脑瘤相关基因LRRC4编码蛋白IgC2结构域的分离、表达与纯化

摘要

我室王洁如博士采用定位候选克隆方法从多种肿瘤高频缺失区7q31-32克隆了一个富亮氨酸重复（leucine-richrepeats,LRR）超家族新成员,经人类基因组国际命名委员会同意,将该新基因命名为LRRC4.该基因在正常脑组织中相对特异表达,而在80﹪（48/60）原发性脑瘤中表达明显下调或缺失.生物信息学分析LRRC4基因含有7个典型LRR结构域、两个富含苏氨酸的LRR结构,一个免疫球蛋白C2样（IgC2）结构域和两个跨膜区.IgC2结构域属于免疫球蛋白超家族.运用生物信息学我们分析了IgC2结构域的一级结构,二级结构,亲、疏水性,抗原性,三维结构等特点,选取包含IgC2结构域的两段氨基酸序列进行融合蛋白表达分析,以比较其融合蛋白表达效果,选取表达量大的融合蛋白片段纯化分离IgC2结构域.在未纯化GST-IgC2融合蛋白的情况下,采用含融合蛋白的凝胶和包涵体沉淀（经变性与非变性处理）直接免疫兔,制备抗GST-IgC2的多抗.

目录

缩写词简表

ABSTRACT

前言

材料与方法

一、材料

1.菌株和质粒载体

2.试剂

3.仪器

二、方法

1.质粒DNA抽提

2.生物信息学分析

3.IgC2结构域原核表达重组体的构建

4.IgC2结构域融合蛋白的表达及纯化

5.多抗的制备

6.Western blotting检测IgC2结构域融合蛋白的表达、纯化和多抗

结果

第一部分IGC2结构域的分离与表达

一、IgC2结构域的生物信息学分析

二、GST/IgC2融合蛋白表达重组体的构建与鉴定

三、GST/IgC2融合蛋白的表达和检测

第二部分GST/IGC2融合蛋白的纯化

一、凝胶洗脱GST/IgC2融合蛋白表达

二、GST/IgC2融合蛋白的亲和纯化

第三部分HPLC对GST/IGC2融合蛋白的分析和纯化

一、HPLC分离凝胶洗脱的融合蛋白

二、HPLC分析亲和纯化的融合蛋白的纯度

三、溶解包涵体的HPLC分离色谱

第四部分IGC2结构域蛋白多抗的制备

一、多抗的制备

二、IGC2结构域蛋多抗的检测

讨论

1.蛋白质功能研究与结构域的关系

2.生物信息学在蛋白质结构功能分析中的作用

3.原核蛋白的表达

4.包涵体的变性与复性

5.HPLC在蛋白质纯化中的作用

结论

参考文献

综述

致谢

个人简历