腺相关病毒载体介导人血管抑素K1-5基因预防和治疗B16黑色素瘤的对比研究

摘要

目的：研究重组腺相关病毒载体介导人血管抑素K1-5基因(rAAV-AG)肌肉注射对B16F10恶性黑色素瘤生长的影响，比较rAAV-AG在预防肿瘤生长和治疗肿瘤方面的不同作用。 方法：(1)、分子克隆法构建含人血管抑素(K1-5)基因表达盒的rAAV病毒载体。 (2)、建立B16黑色素瘤皮下移植瘤和血行转移瘤动物模型。 (3)、预防肿瘤生长：rAAV-AG(5×1011v.g./只)单次肌注后2周皮下接种B16黑色素瘤细胞，观察肿瘤生长情况并绘制肿瘤生长曲线，接瘤后40天处死小鼠剥离瘤块，称瘤重，计算抑瘤率。 (4)、预防血行转移：rAAV-AG(5×1011v.g./只)单次肌注后2周小鼠尾静脉接种B16黑色素瘤细胞，接瘤后40天处死小鼠，计算肝、肺表面转移结节数，计算抑瘤率。 (5)、治疗肿瘤：小鼠皮下接种B16黑色素瘤细胞，肿瘤长至0.2cm3时肌注不同剂量的rAAV-AG，观察肿瘤生长情况并绘制肿瘤生长曲线，计算接瘤后40天的肿瘤体积并求不同剂量组的抑瘤率；继续观察小鼠生存情况，Kaplan-Meier生存分析各组的中位生存时间和生存率，绘制荷瘤小鼠的生存曲线。 (6)、免疫组化法检测各组肿瘤组织中的微血管密度(MVD)。 (7)、TUNEL法检测各组肿瘤组织中的凋亡细胞数。 (8)、WesternBlot法定性检测各组小鼠血清及注射部位肌肉组织血管抑素表达情况。 结果：(1)、重组质粒rAAV-AG经酶切鉴定结果正确，点杂交法测定的rAAV-AG滴度为5×1011v.g.。 (2)、rAAV-AG单次肌注后第2周即可在小鼠血清中检测到血管抑素的表达；实验结束时(最长为接瘤后70天)在小鼠注射部位肌肉组织可检测到血管抑素的表达。 (3)、预防肿瘤生长组：实验组与空白载体组或生理盐水组比较，抑瘤率均为97％，p0.01；实验组小鼠肿瘤一直处于休眠状态，2/6小鼠肿瘤消退。(4)、预防血行转移组：接瘤后40天实验组小鼠肝、肺表面转移结节数均较生理盐水对照组明显减少，抑瘤率分别为37.5％和47.7％，经统计学处理有显著性差异。 (5)、治疗肿瘤组：低(1×1011v.g.)、中(5×1011v.g.)、高(25×1011v.g.)剂量各组在接瘤后40天与生理盐水组比较，抑瘤率分别为44％、61％和65％，低剂量组与生理盐水组比较无显著性差异，p=0.06，中、高剂量组与生理盐水组比较有显著性差异，p＜0.01；Kaplan-Meier生存分析显示低、中、高剂量各组的中位生存时间分别为58天、66天和68天，与生理盐水组(46天)比较，低剂量组无显著性差异，而中、高剂量组有显著性差异。在实验结束时(接瘤后70天)，生理盐水组及低、中、高剂量组的生存率分别为0％、16.6％、50％、50％。 (6)、在预防肿瘤生长组，基因治疗后肿瘤MVD明显减少，肿瘤凋亡细胞数增加，无论与空白载体组或生理盐水组比较均有显著性差异，p=0.01。在治疗肿瘤组，低剂量基因治疗组无论在MVD或肿瘤凋亡细胞数方面与生理盐水组比较均无显著性差异，p值＞0.05；中、高剂量基因治疗组与生理盐水组比较，MVD和肿瘤凋亡细胞数两方面均有显著性差异，p值＜0.01。 结论：(1)、rAAV-AG单次肌注能有效抑制B16恶性黑色素瘤的生长，并延长荷瘤小鼠的生存期。 (2)、在一定剂量范围内rAAV-AG的抑瘤效应呈剂量依赖性，但达到一定剂量后，再增加剂量并不能增强其抗瘤效应。 (3)、rAAV-AG预防肿瘤生长比治疗肿瘤更有效。 (4)、rAAV-AG抑瘤效应可能是通过抑制肿瘤血管生成、诱导肿瘤细胞凋亡来实现的。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词简表及技术路线图

前 言

材料与方法

第一部分 含人血管抑素基因表达盒的rAAV病毒载体的构建

第二部分 rAAV-AG对动物实体瘤的生长抑制作用

第三部分 肿瘤微血管密度、凋亡细胞数及血管抑素检测

结 果

2.1 rAAV载体质粒pSNAV-K5的鉴定

2.2 rAAV-AG单次肌注后血清中血管抑素表达时间的定性检测

2.3 rAAV-AG单次肌注预防肿瘤生长

2.4 rAAV-AG单次肌注预防肿瘤血行转移

2.5不同剂量rAAV-AG对荷瘤小鼠肿瘤生长及小鼠生存期的影响

2.6肿瘤微血管密度和凋亡细胞数检测

2.7 注射部位肌肉组织血管抑素定性检测

讨 论

结 论

参考文献

综述一 血管生成及抗血管生成肿瘤治疗

综述二 抗肿瘤血管生成基因治疗

致 谢

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附：个人简历