嗜盐古生菌rad25基因上游序列在三域生物中的启动子功能研究

摘要

利用大肠杆菌启动子探针载体pKK232-8，从极端嗜盐古生菌中基因组DNA分离得到一个能在真细菌域(大肠杆菌)中具有启动子活性的RM10DNA片段。DNA序列查询发现它包含了嗜盐古生菌rad25基因部分编码序列和上游调控序列；DNA序列分析表明该片段既含有类似嗜盐古生菌启动子和真核生物RNA聚合酶Ⅱ启动子的TATAbox特征序列等，也含有典型的真细菌启动子-35和-10区特征序列。 在嗜盐古生菌中，以β-半乳糖苷酶基因(bgaH)为报告基因，构建了RM10片段和报告基因相融合的重组质粒，通过检测报告基因转录的mRNA和表达的酶活性，证明了RM10DNA片段的确具有启动子功能。通过构建了一系列RM10不同缺失片段融合到报告基因上游的重组质粒，检测了RM10不同缺失片段的启动子活性大小，在嗜盐古生菌中浓缩定位了RM10片段中对于启动子活性有影响的重要功能区，结果表明：rad25基因5'端上游含有TATAbox和BRE特征序列(-305至-130)是片段中对启动子活性有影响的关键功能区。 在大肠杆菌中，利用氯霉素抗性基因(cat)作为报告基因，构建了RM10片段和报告基因的融合质粒，通过检测报告基因的转录和抗性水平，结果表明RM10片段在大肠杆菌具有启动子功能。通过构建缺失片段插入报告基因上游的重组质粒，在大肠杆菌对RM10片段进行了缺失突变分析，确定了rad25基因5'端上游序列包含TATAⅠ特征序列的-305～-250区段是影响RM10片段在大肠杆菌的启动子活性关键部分。结果说明rad25基因5'端上游序列在大肠杆菌有启动子功能和在嗜盐古菌中有启动子功能在序列上既存在差异，同时又是相互联系的。 在酿酒酵母菌和哺乳动物细胞中，分别利用G418抗性基因(neor)、绿色荧光蛋白基因(egfp)、荧光素酶基因(Luc+)为报告基因，构建各种RM10片段和报告基因相融合的重组质粒，通过检测报告基因表达的抗性水平、绿色荧光和酶活性，证实RM10在真核生物中具有启动子功能。通过构建缺失片段融合到报告基因上游的重组质粒，对RM10片段进行了缺失突变分析，结果表明：在酿酒酵母中，含有TATAⅣ和多个GGCGGbox特征序列的-1767～-889区段对RM10片段在酵母菌中具有强启动子活性很重要，包含TATAⅢ特征序列的-889～-403区段是RM10片段在酵母菌中有启动子活性的基本的区段，包含TATAⅡ特征序列的-403～-329区段对RM10片段在酵母菌中有启动子活性有一定影响。在动物细胞中，含有TATAⅢ、TATAⅡ和TATAⅠ特征序列的+1～-889区段启动子活性最大，含有TATAⅢ特征序列的-889～-403区段、TATAⅡ特征序列的-403～-305区段、和TATAⅠ特征序列的-305～-197区段每段都对RM10片段在细胞中有启动子活性都有非常重要的影响。在每种真核细胞中，其启动子活性与推测的真核启动子特征序列基本上是一致的，在不同的真核细胞中，其主要功能区既存在差异又是相互联系的。 将精确、灵敏、快捷的微量量热方法应用于启动子的结构与功能研究，进一步证实了RM10片段在酵母和大肠杆菌中的启动子功能，获得了一系列的动力学和热力学参数，分析了这些参数与启动子功能的关系，热化学研究结果与生物学的研究结果相一致，充分体了化学与生物学学科交叉的优势。

目录

文摘

英文文摘

原创性声明和关于学位论文使用授权说明

第一章引言

1.古生菌

1.1古生菌的分类

1.2古生菌的细胞学特征

1.3古生菌的基因组

1.4古生菌的DNA复制与修复

1.5古生菌的转录

1.6古生菌的DNA翻译

2.极端嗜盐古生菌

2.1极端嗜盐古生菌概述

2.2盐杆菌属的特点

2.3研究极端嗜盐古生菌的生物学意义

3.古生菌基因启动子的特征

3.1古生菌基因启动子的特征

3.2古生菌基因启动子与其它两域生物启动子的异同

4.微量热化学技术在微生物学研究中的应用

4.1微量热化学技术在微生物学研究中的特点

4.2微量热化学技术在研究微生物学中应用

5.本研究的内容和意义

第二章材料及方法

2.1材料

2.2方法

第三章盐杆菌中RM10片段的序列分析和在嗜盐古菌中的启动子功能研究

3.1结果

3.1.1 RM10片段的DNA序列测定及其结构特征分析

3.1.2 RM10片段在嗜盐古生菌中的启动子功能研究

3.2小结与讨论

第四章RM10在大肠杆菌中的启动子功能分析

4.1结果

4.1.1以cat基因为报告基因检测RM10片段在大肠杆菌中的启动子活性

4.1.2在大肠杆菌中检测不同RM10缺失片段的启动子活性

4.2小结与讨论

第五章RM10片段在真核生物中的启动子功能研究

5.1结果

5.1.1研究RM1 0片段在酵母菌中的启动子功能

5.1.2在CHO和Hela细胞中研究RM10片段的启动子功能

5.1.3在COS细胞中利用萤光素酶做报告基因缺失分析RM10的启动子功能

5.2小结与讨论

第六章微量量热方法研究RM10片段在大肠杆菌中和酵母中的启动子功能

6.1结果

6.1.1大肠杆菌中用微量热方法研究RM10片段的启动子功能

6.1.2在酵母菌中用微量热方法研究RM10片段的启动子功能

6.2小结与讨论

总结

本研究工作的主要创新点

参考文献

附录 博士期间发表和投稿的文章

致谢