siRNA沉默TGF-β1对大鼠肾系膜细胞纤维连接蛋白和Ⅳ型胶原的影响

摘要

第一部分，目的：构建载体表达shRNA以沉默TGF-β1的表达，观察其减少系膜细胞表达纤维连接蛋白(Fn)和Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)的作用，探讨用shRNA防治肾脏纤维化的新途径。 方法：针对SD大鼠TGF-β1 mRNA的538-556和895-913的核苷酸序列构建表达shRNA的载体、转染SD大鼠系膜细胞，通过RT-PCR动态观察系膜细胞TGF-β1和Fn的mRNA的变化、通过ELISA动态观察TGF-β1、Fn和Col-Ⅳ蛋白的变化，同时用WesternBlot进一步证实TGF-β1、Fn的改变。 结果：通过对构建的3个质粒进行DNA测序发现，针对SD大鼠TGF-β1 mRNA的538-556和895-913的2条序列之一或二已被分别成功地插入了相应的质粒pEGFP6载体中；将已构建好的3个载体分别转染SD大鼠系膜细胞后，发现2条干扰序列中，只有针对TGF-β1mRNA 538-556的干扰序列，具有显著的干扰效应，表现为沉默TGF-β1mRNA效应持续48hrs(RT-PCR)、沉默TGF-β1蛋白分泌(细胞上清)持续48hrs、沉默细胞内TGF-β1蛋白持续到72hrs。相应地，TGF-β1的有效沉默有效地延缓了脂质体刺激所导致的Fn分泌峰值的出现，而系膜细胞总Col-Ⅳ蛋白的表达在24hrs、48hrs也显著性下调。 结论：针对SD大鼠TGF-β1 mRNA 538-556序列构建的shRNA表达载体pEGFP6，能够有效沉默系膜细胞TGF-β1的表达，伴Fn和Col-Ⅳ蛋白表达的显著下调，可能具有显著的抗纤维化效应。 第二部分，目的：为了沉默系膜细胞TGF-β1 mRNA的表达，构建针对SD大鼠TGF-β1基因的小发夹RNA(small hairpin RNA，shRNA)表达载体pEGFP6 vector，以便于用该载体转染SD大鼠系膜细胞，在系膜细胞内表达shRNA发挥沉默效应。 方法：针对SD大鼠的TGF-β1 mRNA的538-556和895-913核苷酸序列，分别设计2段各含有19nt的干扰序列。在体外按照5′→3′方向人工合成依序为干扰序列正义链(或反义链)、Loop环和反义链(或正义链)及相应部位的多克隆酶切位点和终止信号，得到小发夹cDNA正义链(或反义链)长链结构，然后将合成的小发夹cDNA正、反义链混合、高温融解、退火得到小发夹cDNA(small hairpin cDNA)双链，再用T4 DNA连接酶将其插入pEGFP6-1或pGEGP6-4 VectorU6的BamHⅠ和EcoR Ⅰ之间，重组体转化大肠杆菌DH5α，筛选kana抗性克隆，提取质粒，分别对构建的表达载体进行酶切、测序，确认得到两种能够表达一条干扰序列的质粒，然后再继续将这两个质粒进行SalⅠ+PstⅠ双酶切，分别回收含有两个干扰序列的大、小片段，用T4DNA连接酶连接、转化大肠杆菌DH5α、筛选kana抗性克隆、提取质粒，再行酶切和DNA测序鉴定。 结果：酶切和DNA测序证实，针对SD大鼠TGF-β1 mRNA的两个序列己分别(表达单条)或同时(表达2条)正确地插入了pEGFP6质粒中。 结论：分别得到了能够表达单条shRNA的质粒2个或同时表达2条shRNAs的质粒1个。 第三部分，目的：用构建好的能够表达TGF-β1 shRNA的pEGFP6质粒转染SD大鼠系膜细胞，动态观察其沉默系膜细胞TGF-β1的效应情况。 方法：通过使用脂质体Lipfectamine<'TM>2000将表达TGF-β1 shRNA的pEGFP6质粒转染SD大鼠系膜细胞，然后分别在24hrs、48hrs、72hrs时间段内观察系膜细胞表达TGF-β1的变化：分别用RT-PCR和ELISA测定观察系膜细胞TGF-β1mRNA半定量和细胞培养上清中TGF-β1蛋白的动态变化，用western Blot测定72hrs时间段内系膜细胞内TGF-β1的表达。最后通过SPSS10.0统计学软件做统计学处理，找出干扰效应最好的干扰序列和时间段。 结果：针对SD大鼠TGF-β1 mRNA位点538-556的shRNA，能够显著性地沉默系膜细胞TGF-β1的表达，其中沉默TGF-β1的mRNA效应持续48hrs(RT-PCR)、沉默TGF-β1蛋白分泌(细胞上清ELISA)持续48hrs、沉默细胞内的TGF-β1蛋白持续到72hrs；而针对SD大鼠TGF-β1 mRNA位点895-913的shRNA没有显示出明显的特异性干扰效应；能够同时表达上述2条干扰序列的质粒载体，显示出了二者干扰效应的叠加倾向。 结论：针对SD大鼠TGF-β1 mRNA位点538-556的特异性shRNA能够在mRNA和蛋白水平上显著性沉默SD大鼠TGF-β1基因的表达；表达2条干扰序列的质粒载体，显示出干扰效应叠加的倾向。 第四部分，目的：在shRNA有效沉默TGF-β1情况下，观察系膜细胞表达纤维连接蛋白(fibronectin，Fn)和四型胶原(type Ⅳ collage，Col-Ⅳ)的动态变化。 方法：在表达TGF-β1 shRNA的pEGFP6质粒转染SD大鼠系膜细胞后，观察系膜细胞表达Fn和Col-Ⅳ的变化及其与TGF-β1沉默效应的关系，对于24hrs、48hrs和72brs系膜细胞的Fn mRNA表达及细胞培养上清中的Fn和Col-Ⅳ蛋白浓度，分别采用RT-PCR和ELISA方法动态观察。 结果：在脂质体Lipfectamine<'TM>2000刺激下，除了TGF-β1被有效沉默的2组外，各组系膜细胞分泌Fn显著增加，并于24hrs达到峰值浓度，而TGF-β1被有效沉默的2组的Fn升高没有前者明显(P<0.01)，其峰值浓度被推迟到48hrs才出现；各组的Fn mRNART-PCR半定量也呈现出类似的变化。各组系膜细胞蛋白提取液中ELISA测定Col-Ⅳ蛋白提示，TGF-β1被有效沉默的2组均出现了Col-Ⅳ的显著下降，以24hrs、48hrs为明显，72hrs仍有低于对照组的倾向，但无统计学差异。 结论：shRNA沉默TGF-β1的表达，能够显著下训Col-Ⅳ的表达，延缓Fn峰值的出现。脂质体Lipfectamine<'TM>2000可能通过TGF-β1非依赖途径刺激系膜细胞分泌Fn。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分表达SD大鼠TGF-β1 siRNA的pEGFP6 vector载体的构建

1材料与方法

2实验结果

3讨论

参考文献

小结

第二部分siRNA沉默系膜细胞TGF-β1的研究

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

小结

第三部分siRNA沉默TGF-β1对系膜细胞Fn和Col-Ⅳ的影响

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

小结

综述 系膜增生性肾小球肾炎发病机制的研究进展

攻读学位期间主要研究成果

致谢