Celecoxib对人宫颈癌HeLa细胞中HPV18E6mRNA及蛋白表达的影响

摘要

目的：用环氧化酶2抑制剂Celecoxib干预宫颈癌HeLa细胞株后，观察HeLa细胞生长、增殖、凋亡情况，研究其中HPVE6和COX2基因表达的变化，初步研究HPV与COX2的相关性。 方法：用不同浓度Celecoxib干预HeLa细胞株24h后：(1)采用HPV18E6单克隆抗体及免疫细胞化学SP法检测HPV18E6蛋白的表达变化； (2)四唑氮蓝(MTT)比色法检测其对细胞增殖的影响；(3)流式细胞仪测定细胞凋亡情况；(4)Hoechst33258染色观察Hela细胞在形态学的变化；(5)RT-PCR检测HPVl8E6及COX2mRNA表达的改变。 结果：(1)HeLa细胞中HPVl8E6免疫细胞化学检测染色阳性着色颗粒位于细胞浆，部分位于胞核，均可见深棕褐色颗粒，表达呈强阳性。实验组终浓度分别为10 μ mol／L、20 μ mol／L、40μmol／L、80 μmol／L的Celecoxib作用于HeLa细胞24h后，其胞质内E6蛋白表达明显下降，着色细胞变淡变少，随着浓度增加表达由阳性渐变为阴性，对照组与实验组的阳性表达率分别为100％、72％、49％、9％、0％，实验组与对照组的表达率经卡方检验相比较差异显著(X<'2>=27.858 P<0.05)。 (2)经终浓度分别为10 μ mol／L、20 μ mol／L、40 μ mol／L、80μmol／L、160 μmol／L Celecoxib处理HeLa细胞24h后，MTT检测各实验组细胞活力分别为对照组细胞活力(A490值)的87.06％±1.72％、46.99％±2.42％、11.92％±1.15％、6.48％±1.35％、2.08％+0.62％，与对照组比较有明显差异(F=2659.17 P(0.05)。在一定浓度范围内随着Celecoxib浓度的增加，对HeLa细胞抑制率显著增加，呈量效关系(相关度比较R=-0.777 P(0.05)。 (3)Hoechst33258荧光染色显示经20μmol／L Celecoxi作用Hela细胞24h后表现为细胞体积变小，细胞浆密度增大、颜色变深，染色质致密固缩聚集于细胞核，核膜呈境界分明的块状或新月形小体，有凋亡小体形成及核裂解。 (4)流式细胞仪显示各实验组Celecoxib(终浓度分别为10μmol／L、20μmol／L、40μmol／L、80μmol／L)作用Hela细胞24h后对照组和各实验组凋亡率分别为2.42％±0.41％、9.56％±1.71％、21.52％±1.95％、30.59％±2.12％、36.34％±2.12％，各浓度组细胞凋亡率与对照组之间有显著差异(F=187.3 P<0.05)，并且呈剂量依赖性(R=0.919 P<0.05)。 (5)凝胶图像分析仪分析RT-PCR产物：实验组Celecoxib(终浓度分别为10 u mol／L、20 u mol／L、40 u mol／L、80 u mol／L)作用Hela细胞24h前后，各实验组和对照组HPVl8E6mRNA／β—actin及COX2mRNA／β—actin分别0.59±0.01、0.40±0.2、0.34±0.02、0.06±0.03、0.04±0.01；0.58±0.02、0.41±0.02、0.17±0.01、0.06±0.01、0.03±0.02，随着Celecoxib浓度的升高，其表达随之下降，经方差分析对照组和实验组之间差异具有显著性(F<,(HPY)>=434.05 F<,(cox2)>=505.18均P<0.05)，且两者显著相关性(R=0.947 P<0.01)。 结论：1、Celecoxib能下调宫颈癌HeLa细胞株中HPVl8E6蛋白的表达，抑制HPV的复制。 2、COX2在宫颈癌发生、发展中与HPV可能存在协同作用。 3、Celecoxib对HeLa细胞株可能通过下调COX2的途径实现抗增殖、促凋亡作用，抑制作用呈量效关系。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

原创性声明及关于学位论文使用授权说明

第一章　前言

第二章　材料与方法

第三章　结果

第四章　讨论

第五章　结论

第六章　参考文献

综述人乳头瘤病毒诱发宫颈癌发生的分子机制研究进展

致谢