用原核增强子提高hTERT启动子介导的基因表达

摘要

为探讨原核增强子能否提高人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子的转录活性及对其特异性的影响，将增强子SV40、CMV分别或组合插入到hTERT 启动子的上游或报告基因的下游，构建一系列GFP和荧光素酶报告基因质粒载体，转染人肝癌细胞(BEL7402)、人鼻咽癌细胞(CNE2)、人宫颈癌细胞(Hela)、人结直肠癌细胞(SW480)、人成纤维肉瘤细胞(HTl080)和正常人成纤维细胞(HDF)。通过在荧光显微镜下直接观察和双荧光素酶分析系统检测报告基因的表达效率。以找出在这几种肿瘤细胞中作用最好的转录调控元件。 实验结果表明：在HDF中这些载体表达效率低；在肿瘤细胞中hTERI、启动子能介导基因表达，且不同的增强子在不同细胞中能不同程度的增强基因表达的能力，SV40增强子可使hTERT启动子活性提高3-10倍；CMV增强子能提高3-26倍，特别是在BEL-7402、Hela和CNE2细胞中使荧光素酶表达提高了20-26倍，是常用的CMY增强子/启动子元件的2—7倍，但在HTl080和SW480细胞中它与CMv增强子/启动子元件的作用无明显差别；SV40加CMV的双增强子与单独CMV增强子的作用相似，只在HELA细胞中是单独CMv增强子的1.2—1.3倍。此外hTERT启动子前加一个完整CMV增强子/启动子的策略不可取。 这些研究证实，hTERT启动子能有效介导外源基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中表达，增强子能显著增强hTERT启动子的转录活性并对其肿瘤特异性没有影响。对于SW480 和 HTl080，CMV增强子/hTER启动子有很好的特异性，但在表达效率上较之CMV增强子/启动子没有优势。而对于BEt7402、Hela和CNE2，CMV增强子/HTERT启动子或SV40-CMV双增强子/HTERT启动子是一种既高效又特异的通用质粒载体，在靶向性肿瘤基因治疗中具有巨大应用潜力。 为进一步证实筛选的转录调控元件在“人源载体用于肝癌基因治疗”研究领域的作用，构建人源载体一自杀基因：pHr—CeTpCDUPRT/GFP进行肝癌基因治疗的体外研究。体外转染肝癌细胞BEL7402，流式细胞仪检测转染效率为30[％]-50[％]；RT-PCR和Western B1ot检测到CDUPRI、基因有表达；加入前体药物5-FC后12小时，HPLC检测到细胞上清中5-FU浓度为60.15ug/ml；MTT分析平均细胞存活率为60[％]一35[％]。 这些结果为应用此载体进行肝癌基因治疗提供了重要的实验依据。

目录

文摘

英文文摘

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前言

第一章用原核增强子提高hTERT启动子介导的外源基因表达

第二章肿瘤特异性杀伤载体的构建及其功能研究

结论

参考文献

综述 增强子研究进展

致谢

攻读学位期间主要的研究成果及个人简历