表达HCV NS3蛋白肝细胞中ERK与NF-κB、JAK/STAT信号转导通路间的cross-talk研究

摘要

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤，流行病学研究显示肝炎病毒感染、黄曲霉毒素的摄入及酗酒是其重要的致病因素。分子生物学技术的飞速发展及细胞信号转导的深入研究，对HCC发生机制的阐明起到了重要的推动作用。丙型肝炎病毒(hepatitis virus C,HCV)是HCC的重要致病因子之一，持续的感染可导致慢性丙型肝炎，并可发展为肝硬化和肝细胞癌，其致癌机制尚不清楚。据统计，目前全世界约有1.5亿人口感染丙型肝炎病毒。 HCV是一种正链RNA病毒，无逆转录酶活性，只能在细胞胞浆内复制，不能与宿主基因整合，主要是通过其表达的蛋白质作用于宿主细胞发挥其致癌效用，其中HCVNS3、NS5和核心蛋白与HCC的发生关系尤为密切。 HCV NS3蛋白是含631个氨基酸(1026—1656)的胞浆蛋白。HCV NS3蛋白表达质粒转染MH／3T3细胞后，细胞端粒酶活性显著增高；本实验小组前期研究证实HCV NS3蛋白N端多肽可以诱导QSG7701细胞株转化，并接种裸鼠成瘤。这些结果均提示HCV NS3蛋白是HCV相关性HCC发生的重要因子。 肿瘤的发生是一个多因素、多阶段发展的过程，涉及细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡及信号转导等诸多方面。尤其是信号转导与疾病关系已成为生命科学研究领域的热点和前沿，故本研究拟探讨细胞外调节激酶(ERK)通路在HCV NS3蛋白介导的细胞增殖中的作用机制，ERK 通路与NF-r.B、JAK／STAT通路之间可能存在的cross-talk及其在肝细胞增殖和恶性转化中的作用。 HCV为嗜肝细胞病毒，其自然宿主是人或黑猩猩，利用转基因鼠或非人源肝细胞作为研究体系，不能真实反映HCV感染的自然进程，所获结果难以令人信服。本研究小组采用人源永生化肝细胞系QSG7701作为实验对象，将表达HCV NS3蛋白的真核细胞表达质粒 (pcDNA3.l-NS3)转染人肝细胞系QSG7701，建立稳定表达HCV NS3蛋白的细胞系QSG7701／NS3，李波博士成功进行了鉴定。本实验采用OSG7701、pcDNA3.l／QSG7701以及QSG7701／NS3①②③五组细胞，Western blot检测HCV NS3蛋白对MAPK信号转导途径的影响。结果显示QSG7701／NS3细胞中磷酸化的P38<'MAPK>和JNK的表达水平与pcDNA3.1／QSG7701和QSG7701细胞无明显差异，但磷酸化的ERK(P44／42<'MAPK>)表达水平明显升高，提示HCV NS3蛋白可能通过增强ERK(P44／42<'MAPK>)的磷酸化而促进肝细胞的增殖，从而在HCC发生中起作用。信号转导通路最终均通过核转录因子(如AP-1、NF-κB、STAT3)作用于细胞基因组调节细胞生物学行为。本实验小组前期结果显示HCV NS3蛋白上调AP-1、NF-κB、STAT3的DNA活性。本实验检测了HCV NS3蛋白对cyclinDl表达水平的影响，结果显示QSG7701／NS3细胞cyclinDl表达水平明显高于ncDNA3.1／QSG7701和QSG7701细胞。我们推测HCV NS3蛋白促进QSG7701细胞增殖可能通过激活ERK／AP-1级联，继而上调cyclinDl实现的。 为了进一步阐明HCV NS3蛋白通过ERK(P44／42<'MAPK>)信号通路的促细胞增殖作用，观察ERK与NF-κB、JAK／STAT信号途径间是否存在cross-talk以及它们在肝细胞恶性转化过程中作用，我们采用ERK激酶MEK的抑制剂PD98059(OμM、30μM、50μM、100μM)处理QSG7701／NS3细胞，利用Western blot检测ERK的磷酸化及cvclinDl的表达水平；凝胶电泳阻滞迁移试验(EMSA)检测AP-1、NF-κB、STAT3转录因子活性的改变；流式细胞术(FCM)检测细胞各周期百分数的改变；MTT比色法观察对细胞增殖的影响。结果：PD98059处理QSG7701／NS3后，其ERK磷酸化水平和cyclinDl表达水平明显降低；同时，AP-1、NF-κ3和STAT3的DNA结合活性显著下调，且呈剂量依赖关系。结论：从反面进一步证实ERK通路HCV NS3介导的细胞增殖中发挥重要作用；ERK和NF-κB、ERK和STAT3之间可能存在cross-talk，HCVNS3蛋白在激活ERK信号转导通路的同时通过cross-talk激活NF-κB、JAK／STAT3信号通路，在HCV NS3致细胞增殖和恶性转化中可能发挥协同作用。

目录

文摘

英文文摘

原创性声明及关于学位论文使用授权说明

实验技术路线

英文缩写注解

第一章HCV NS3蛋白对MAPK信号转导通路及细胞周期素D1（cyclin-D1）表达水平的影响

第二章阻断ERK通路对HCV NS3蛋白表达质粒转染细胞增殖的影响

第三章表达HCV NS3蛋白的人源肝细胞中ERK信号通路与NF-кB、STAT3信号通路间的cross-talk

第四章结论

综述 JAK/STAT信号通路与丙型肝炎病毒感染

致谢

攻读学位期间的主要成果