神经生长因子致哮喘神经源性炎症信号传导通路研究

摘要

支气管哮喘是由多种免疫炎症细胞(如肥大细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞等)及其细胞组份参与的以反复发作可逆性气流受限和气道高反应性为特征的气道慢性非特异性炎症性疾病。目前认为，神经源性炎症是支气管哮喘发病的重要机制。最近研究其在NGF所致哮喘神经源性炎症的作用机制有望成为治疗哮喘发病的新靶点。 第一部分：神经生长因子调控哮喘大鼠气道神经源性炎症的信号传导通路初探 通过鸡卵蛋白(OVA)致敏激发建立哮喘模型，将SD大鼠随机分为3组：哮喘组、正常对照组、抗NGF组，每组12只。模型建立后进行以下研究：取肺组织切片HE染色观察病理改变，以此观察模型的气道炎症程度。取三组大鼠肺组织、背根节采用免疫组化对pan-Ras、pERK、c-fos蛋白进行定位和定性分析。结果显示：在肺组织中pan-Ras、pERK、c-fos阳性反应物质均呈棕黄色，主要位于细胞浆中。哮喘组呈强阳性反应，正常对照组呈弱阳性反应。哮喘组pan-Ras、pERK、c-fos平均灰度值分别为152.65±15.95、152.89±13.52、130.62±10.46较正常对照组(pan-Ras、pERK、c-fos 平均灰度值分别为 174.74±14.61、179.55±13.83、165.04±11.57)阳性产物的平均灰度值均明显降低(P<0.01)。抗NGF组大鼠肺组织中免疫反应阳性细胞表达较哮喘组明显减少，呈弱阳性反应 (pan-Ras、pERK、c-fos 平均灰度值分别为 174.08±14.94、177.80±15.08 及 165.02±11.33)。背根节中 pan-Ras、pERK、c-fos阳性反应物质均呈棕黄色，pan-Ras、pERK主要位于细胞浆中，而c-fos 位于细胞浆和细胞核中。正常对照组呈弱阳性反应，哮喘组呈强阳性反应，抗NGF组呈弱阳性反应。哮喘组pan-Ras、pERK、c-fos平均灰度值分别为 151.40±15.89、154.84±13.22、137.21±13.05 较正常对照组 171.44±16.43、175.34±13.24、175.51±7.76明显降低，P<0.01。抗NGF干预后，pan-Ras、pERK、c-fos 表达减少，其灰度值分别为168.41±17.27、170.78±13.34及163.89±8.92，较哮喘组有统计学差异，P<0.05。 第二部分：人支气管上皮细胞NGF信号传导通路初探 我们选用参与哮喘神经源性炎症的重要效应细胞一正常人支气管气道上皮细胞株(NHBEC)作为研究对象。NHBEC于含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养。实验分8组：(1)A组：正常对照组；(2)B组：NGF组；(3)C组：NGF+PD98059组；(4)D组：PD98059组；(5)E组：NGF+PMA组；(6)F组：PMA组；(7)G组：NGF+AG490组(8)H组：AG490组。并分别进行细胞干预。干预后免疫印迹法半定量测定细胞 c-fos、p-ERK及total-ERK 蛋白含量。RT-PCR方法半定量检测各组细胞NK-1R mRNA含量。并应用免疫细胞化学定性观察各组细胞表达NK-1R的情况。结果显示：与正常对照组相比，c-fos 蛋白及磷酸化的ERK1/2蛋白水平在NFG作用30min时，显著增高并达到峰值；而total-ERK蛋白水平则不受NGF影响；在NGF未处理的PD98059组及AG490组c-fos蛋白水平、磷酸化的ERK1/2蛋白水平几乎检测不到；而在NGF组，经NGF作用30min后，可见c-fos蛋白水平及磷酸化的ERK1/2蛋白水平显著增高，c-fos/GAPDH及pERK/GAPDH光密度比值分别为0.8354±0.1012、1.3187±0.2078，与正常对照组相比P<0.01。PD98059可明显抑制NGF诱导NHBEC表达c-fos蛋白及磷酸化的ERK1/2蛋白，c-fos/GAPDH及pERK/GAPDH光密度比值分别为0.3012±0.1034、0.3146±0.0957，与NGF组相比P<0.01。PMA可刺激NGF诱导NHBEC表达c-fos及磷酸化的ERK1/2蛋白。而STAT3传导途径特异性抑制剂AG490则无此作用。免疫细胞化学研究结果显示：正常对照组及PD98059组NK-1R表达呈阴性反应；NGF组及NGF+PMA组呈强阳性反应；PMA组呈阳性反应；而NGF+PD98059组呈弱阳性反应。RT-PCR结果显示：与正常对照组相比，NK-1RmRNA在NGF未处理的PD98059组表达较少；而在NGF组，经NGF作用1h后，可见NK-1RmRNA水平显著增高(光密度比值1.0682±0.1597)，与正常对照组(光密度比值0.3753±0.0642)相比P<0.01。PD98059可抑制NGF诱导NHBEC表达NK-1RmRNA(光密度比值0.4787±0.0981)。PMA可刺激NGF诱导NHBEC表达NK-1RmRNA。 第三部分：c-fos RNAi技术对NGF Ras-MAPK 信号通路的影响 培养NHBEC，设计 c-fos siRNA，通过阳离子脂质体转染至细胞内，再进行NGF干预。实验分(1)A组：正常对照组；(2)B组：NGF组；(3)C组：NGF+dsRNA nonspecific组；(4)D组：NGF+FOS1组；(5)E组： NGF+FOS2组；(6)F组：NGF+FOS3组；(7)G组：NGF+空白载体组。细胞干预后分别提取总蛋白免疫印迹半定量测定各组c-fos蛋白表达；提取总RNA RT-PCR半定量检测NK-1R mRNA，并应用免疫细胞化学法定性检测各组NK-1R表达。结果显示：经NGF刺激后，c-fos蛋白表达较正常对照组明显增加，c-fos/GAPDH 吸光度比值为1.1861±0.1427，较正常对照组(吸光度比值0.3122±0.0914)，P<0.01；c-fos shRNA可抑制NGF诱导NHBEC 表达c-fos 蛋白，c-fos/GAPDH 吸光度比值分别为1.0965±0.2591、0.6574±0.1373、0.3773±0.136；与NGF组比较，P<0.01；无关shRNA，空质粒均无此作用。与正常对照组相比，NHBEC经NGF作用1h后，可见NK-1RmRNA水平显著增高，NK-1RmRNA/beta-actin吸光度比值为1.0047±0.1106，与对照组(NK-1 RmRNA/beta-actin 吸光度比值为0.413±0.0473)比较，P<0.01。FOS3可抑制NGF诱导NHBEC表达NK-1R mRNA，其NK-1RmRNA/beta-actin 吸光度比值为0.6214±0.0971与NGF组相比P<0.01。无关shRNA，空质粒均无此作用。免疫细胞化学结果显示NK-1R阳性产物为棕黄色，以NHBEC胞浆着色为主。正常对照组NK-1R表达呈阴性反应；NGF组及NGF+HK siRNA组呈强阳性反应；NGF+无关siRNA组呈阳性反应；而NGF+siRNA组呈弱阳性反应。 上述三个部分研究提示NGF通过调控神经源性炎症介质SP参与哮喘神经源性炎症机制，其信号通路可能是Ras-MAPK途径。阻断Ras-MAPK信号传导通路，有望成为治疗哮喘的新途径。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一章神经生长因子调控哮喘大鼠气道神经源性炎症的信号传导通路初探

1.1材料与方法

1.2结果

1.3讨论

1.4结论

附图

第二章人支气管上皮细胞NGF信号传导通路初探

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

2.4结论

第三章c-fos RNAi技术对NGF Ras-MAPK信号通路的影响

3.1材料与方法

3.2结果

3.3讨论

3.4结论

参考文献

综述 神经生长因子与哮喘神经源性炎症

1.哮喘神经源性炎症

2.神经生长因子的分子结构及蛋白质结构

3.神经生长因子受体及信号传导通路

3.1神经生长因子高亲和力受体及信号传导通路

3.2神经生长因子低亲和力受体及信号传导通路

3.3神经生长因子受体及信号传导通路与神经源性炎症

4.NGF与哮喘

4.1哮喘发作时NGF升高

4.2 NGF与气道的高反应性

5.NGF与哮喘神经源性炎症

5.1神经源性炎症与哮喘

5.2 NGF与感觉神经

5.3 NGF与感觉神经肽

6.展望

参考文献

致谢

发表论文和研究成果