EB病毒潜伏性膜蛋白-1羧基末端活化区-3在鼻咽上皮细胞转化中的作用及机制

摘要

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是一种在人类普遍流行的γ-疱疹病毒，也是最早被识别的人类肿瘤病毒。EBV与许多人类肿瘤如伯基特淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌和肺癌等的病因以及与部分肿瘤的转移密切相关。EBV潜伏性膜蛋白1(1atent membrane protein 1，LMPl)基因以其单独能促进啮齿类纤维细胞(如Ratl和Balb／C 3T3)和部分永生化上皮细胞恶性转化的特性而被公认为是EB病毒唯一的癌基因。 LMPl基因cDNA全长为1158bp，其产物是一由386个氨基酸(aa)残基组成的60～66KD的完整磷酸化跨膜糖蛋白，包括亲水性氨基端胞浆区(1～23aa)，6个不同的疏水性跨膜区(24～1 86aa)，亲水性羧基端胞浆区(187～386aa)三种结构域，其中羧基末端胞浆区是活化受体转导胞内信号转化，发挥致瘤作用的主要部位，包括3个活化区域(carboxy terminal activationregion，CTAR)分别位于194～232aa(CTAR<,1>)、351～386aa(CTAR<,2>)和275～330aa(CTAR<,3>)，其中CTAR<,3>的功能尚不十分清楚。Gires等曾首次提出CTAR<,3>能活化JAK3(Janus Kinase 3)，继而进一步激活信息传递与转录活化因子(signal transducer and activator of transduction，STAT)，而Izumi等的研究却指出LMPl-CTAR<,3>与JAK3的关系并不明确。为了探讨CTAR<,3>的功能活性，进而阐述LMPl-CTAR<,3>在LMPl致瘤过程中信号机制以及EB病毒相关恶性肿瘤发生发展规律，本课题主要从以下几个方面展开研究： 1、LMPl-CTAR<,3>缺失突变体(LMPl<'Δ232-351>)的构建及功能分析 采用PCR方法构建了LMPl中232～351位密码子对应的氨基酸缺失突变体(LMPl<'Δ232-351>)以及含JAK3启动子核心区域(—289～+35)的荧光素酶表达质粒。测序证实后，将pLNSX-LMPl<'WT>与pLNSX-LMPl<'Δ232-351>(以pLNSX空载体为对照)分别与含有转录因子NF-kB、AP-1或JAK3启动子序列的荧光素酶表达质粒共转染293细胞，单光子检测仪测定比较二者活化不同转录因子的功能。结果发现：LMPl<'WT>明显呈浓度依赖性上调JAK3报告基因活性，而LMPl<'Δ232-351>对其的上调作用几乎丧失。提示LMPl<'WT>参与了JAK3信号通路的活化，CTAR<,3>是LMPl<'WT>发挥这一作用的重要活性部位。 2、 LMPl<'△232-351>转化的鼻咽上皮细胞(NP69)生物学特性分析 采用脂质体转染法将pLNSX-LMPlWT与pLNSX-LMPl<'△232-351>(以pLNSX空载体为对照)导入：PA317包装细胞，600mg/L G418筛选2周后扩大培养，自细胞培养上清获得后续实验所需的感染性逆病毒RV-LNSX、RV-I,MPl<'WT>和RV-L1VIPl<'△232-351>。然后，用浓缩的病毒分别感染鼻咽上皮细胞。NP69，400mg/LG418筛选3周后，汇合克隆培养，获得NP69-pLNSX、NP69-LMPl<'WT>和NP69-LMPl<'△232-351>3种转化细胞系。分别观察和检测这些转化细胞的形态、生长曲线、平板克隆、软琼脂生长能力和抗凋亡能力。结果显示：(1)NP69-LMPl<'△232-351>细胞的形态与NP69-LMPl<'WT>细胞的一样，在培养过程中，逐渐由扁平、鹅卵石样典型上皮形态逐渐演变成细胞间接触减少的长梭状纤维细胞样形态；(2)与NP69-L,MPl<'WT>细胞相比，NP69-LMPl<'△232-351>细胞的生长和增殖能力降低，在软琼脂实验中形成的集落较野生型减少(256±14 VS 88±7,P<0.05)，且集落较小。(3)NP69-LMPl<'△232-351>细胞抗凋亡能力明显低于NP69-LMPl<'WT>细胞(NP69-LMPl<'△232-351>细胞较NP69-LMPl<'WT>细胞的凋亡率为45.34±2.72VS 14.13±1.98，P<0.05)。以上结果提示CTAR<,3>参与了LMPl促细胞增殖、转化和抑制凋亡等信号过程，是LMPl羧基末端重要的转化效应位点之一。 3、 LMPl<'△232-351>转化的鼻咽上皮细胞(NP69)蛋白质组学研究 采用双向凝胶电泳技术(2-DE)分离NP69-pI,NSX、NP69-I_,MPl<'WT>和NP69-LMPl<'△232-351>三株细胞的总蛋白，建立了重复性和分辨率均较好的NP69-pLNSX、NP69-LMP1<'WT>和NP69-LMP1<'△232-351>细胞系的双向凝胶电泳图谱，总蛋白质点数分别为1099±38、1088±43和11424±46，平均匹配率为92.5[％]。与NP69-pLNSX细胞相比，在NP69-LMPl<'WT>细胞中，有27蛋白质点表达上调，24个蛋白质点表达下调；与NP69-I,MPl<'WT>细胞相比，NP69-LMPl<'△232-351>在细胞中表达上调的蛋白质点26个，下调的蛋白质点33个。应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测，共鉴定了39个差异表达的蛋白质点。在这些蛋白质中，NP69-LMPl<'WT>与NP69-pLNSX细胞之间所鉴定的蛋白有参与代谢相关的酶类蛋白柠檬酸合酶；参与信号传导通路的膜联蛋白A2以及参与转录和翻译的相关蛋白延长因子1等，更多的是与细胞恶性程度相关及促细胞转移相关的一些结构蛋白，如波形蛋白、核纤层蛋白．A/C、细胞角蛋白19等。另外，NP69-LMPl<'△232-351>与NP69-LMPl<'WT>细胞之间鉴定的蛋白有参与代谢相关的酶类蛋白如磷酸丙糖异构酶、异柠檬酸脱氢酶；参与信号传导通路的G蛋白；参与转录和翻译相关蛋白如核糖体蛋白PO、非均一型核糖核蛋白A/B/H等。为证实比较蛋白质组学研究结果，采用Real-time quantitative RT-PCR技术对钙网织蛋白、角蛋白19、柠檬酸合成酶、波形蛋白、核纤层蛋白、膜联蛋白A2、核糖体蛋白PO、不均一核糖体蛋白AB、G蛋白和异柠檬酸脱氢酶在NP69-pLNSX、NP69-LMPl<'WT>和NP69-LMPl<'△232-351>细胞株中的表达水平进行了验证，其结果与比较蛋白质组学研究的结果一致。上述结果提示LMPl诱导上皮细胞增殖、转化是一个多因素参与、多步骤调节的过程，可能存在一个复杂的网络。CTAR3作为LMPl的活化区之一，在LMPl参与调节的信号网络中起着十分重要的作用，是LMPl C端重要的活性转化位点之一。上述蛋白质的进一步研究可望阐述其在网络信号中的作用及意义，揭示蛋白质之间的相互作用规律及信号传导途径，为进一步理解EB病毒在鼻咽癌发生发展中的作用和机制提供新的有价值的证据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表及注释

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 Jak/STAT信号转导途径研究进展

附录

致谢

攻读学位期间主要的研究成果