DFO、5-ALA联合诱导大鼠大肠癌组织原卟啉Ⅸ聚积的实验研究

摘要

大肠癌是常见的恶性肿瘤，加强早期大肠癌的诊治，对提高生存率具有重大意义。激光诱发荧光技术为发现早期大肠癌提供了一种崭新的诊断方法，具有其它方法难以取代的优势。δ-氨基-γ-酮戊酸(5-aminolevulinic acid,5-ALA)能诱导肿瘤组织原卟啉Ⅸ积聚，因其本身不具有光敏特性，避免了直接应用卟啉光敏剂进行光动力学诊断所产生的光毒副作用，在药物荧光诊断中具有广阔的应用前景。本课题探讨去铁胺(deferoxamine，DFO)、5-ALA联合诱导大肠癌组织原卟啉Ⅸ聚积的特性，对临床应用DFO、5-ALA联合诱导荧光诊断早期大肠癌的可行性进行基础性实验研究。 研究目的： (1)探讨DFO、5-ALA联合诱导大肠腺癌细胞原卟啉Ⅸ聚积的动力学变化规律及药物浓度、pH值对细胞聚积原卟啉Ⅸ的影响，为该药物诱导大肠癌组织原卟啉Ⅸ聚积实验研究提供参考； (2)为DFO、5-ALA联合诱导大肠癌组织原卟啉Ⅸ聚积实验研究建立大肠癌动物模型； (3)定量分析5-ALA及DFO、5-ALA联合诱导大肠癌大鼠大肠正常组织、早期癌和进展期癌组织原卟啉Ⅸ聚积特征，观察不同组织内原卟啉Ⅸ荧光分布及强度的差异； (4)探讨5-ALA不同用药途经对大肠癌大鼠大肠组织原卟啉Ⅸ积聚的影响，为临床应用DFO、5-ALA联合诱导荧光诊断大肠早癌提供依据。 实验方法：采用体外细胞培养方法以含DFO、5-ALA的培养液孵育大肠腺癌细胞株SW480细胞2小时，于不同时间点终止培养，用高效液相色谱-荧光检测法检测各时点细胞内原卟啉Ⅸ的含量，并分别对DFO、5-ALA联合作用不同时间、不同pH值及不同浓度所诱导产生的细胞原卟啉Ⅸ含量进行比较分析。60只SD(sprague-DaWley)大鼠采用二甲肼腹腔注射诱导，纤微胆道镜动态观察大鼠大肠内变化及成瘤情况。成功诱导含各期大肠癌变的SD大鼠分组分别用生理盐水、5-ALA及DFO+5-ALA注射，4小时后解剖大鼠，取出大肠可疑癌变及正常组织标本，经病理切片确诊的大肠正常组织、早癌组织、进展期癌组织标本分别通过原卟啉Ⅸ提取，用高效液相色谱一荧光检测法检测其原卟啉Ⅸ含量，并对DFO、5-ALA联合诱导不同时间3种组织标本中原卟啉Ⅸ含量进行比较分析，采用激光共聚焦显微镜对3种组织内原卟啉Ⅸ荧光分布及强度进行检测。在DFO腹腔注射大鼠半小时后，5-ALA分别采用静脉注射、口服和保留灌肠3种给药途经诱导，通过对大肠正常组织、早癌组织及进展期癌组织原卟啉Ⅸ进行定量分析、荧光分布观察及强度检测，比较3种不同给药途经对癌变组织原卟啉Ⅸ聚积的诱导效果。 实验结果：细胞学实验显示，大肠腺癌细胞内原卟啉Ⅸ含量在药物作用细胞40分钟后明显升高，在细胞培养4小时(药物终止作用后2小时)达到高峰，之后逐渐下降；在pH值为6.5～7.0、DFO浓度为10～20momL/mL、5-ALA浓度为1.5～2.0momL/mL时，癌细胞内原卟啉Ⅸ含量最高。SD大鼠大肠癌的发生主要呈炎症-萎缩-增生-癌变的发展过程，大肠癌总诱导率为85％，其中多发性肿块占94％。在不同药物诱导的3组大鼠中，各组大鼠大肠组织原卟啉Ⅸ含量由小到大依次为：大肠正常组织、早期大肠癌、进展期大肠癌；3组比较，DFO、5-ALA联合诱导组组织原卟啉Ⅸ含量最高，其早癌和进展癌组织在用药4小时组织原卟啉Ⅸ含量最大、正常组织在用药2小时组织原卟啉Ⅸ含量达到高峰，癌变组织与正常大肠组织原卟啉Ⅸ含量在用药后4小时差异最明显；组织原卟啉Ⅸ红色荧光在正常组织表达最弱，早期大肠癌荧光呈点状散布在癌变组织细胞内，进展期大肠癌病灶局部表现为大量高亮度块状荧光；荧光强度分析：正常组织<早期大肠癌<进展期大肠。在5-ALA不同的3种给药途经中，静脉注射癌变组织原卟啉Ⅸ含量最高；保留灌肠给药取得较好的诱导效果，且癌变组织表层荧光强度大；口服给药癌变组织原卟啉Ⅸ含量最低。 结论： (1)DFO、5-ALA联合诱导大肠腺癌细胞原卟啉Ⅸ聚积的最短诱导时间不得少于40分钟，最佳检测时间为终止药作用后2小时； (2)采用二甲肼腹腔注射、内镜观察的方法诱导SD大鼠，成功建立了本研究需要的多发性包含各期癌变的大肠癌动物模型； (3)5-ALA与DFO联合应用，能显著提高5-ALA诱导癌组织原卟啉Ⅸ的积聚作用，组织原卟啉Ⅸ红色荧光主要集中聚集在癌变组织细胞内，检测最佳时间为用药后4～6小时； (4)5-ALA保留灌肠给药可取得较好的诱导效果。

目录

文摘

英文文摘

声明

前 言

第一章DFO、5-ALA联合体外诱导大肠癌细胞原卟啉Ⅸ聚积的动力学研究

材料与方法

结 果

讨 论

结论

第二章SD大鼠大肠癌动物模型建立

材料与方法

结 果

讨 论

结 论

第二章附图

第三章DFO、5-ALA联合诱导大肠癌大鼠大肠组织原卟啉Ⅸ积聚的定量分析及其荧光分布研究

材料与方法

结 果

讨论

结 论

第三章附图

第四章5-ALA不同用药途经对大肠癌大鼠大肠组织原卟啉Ⅸ积聚的影响

材料与方法

结 果

讨 论

结论

第四章附图

参考文献

总 结

综述：卟啉与早期肿瘤的荧光诊断

致 谢

攻读博士学位期间的主要研究成果