极端环境中嗜铁钩端螺旋菌的选择性分离、鉴定与特性研究

摘要

各种证据表明，在温度≥40℃、pH≤1.4时，钩端螺旋菌在工业连续流生物反应槽中属于主要的铁氧化细菌。目前，在钩端螺旋菌属现存的三个种当中，仅仅嗜铁钩端螺旋菌能够在45℃生长，此外，除了两个抗砷基因被鉴定外，有关这个种的其他生物学特性的报道非常有限。因此，它已成为未来生物学研究的热点。 然而，由于纯培养的困难，有限的嗜铁钩端螺旋菌菌株被分离。在本研究中，以嗜铁钩端螺旋菌为主要研究对象，开展了其分离方法、生理生化特性、分子生物学鉴定和磁小体的提取等研究工作，其主要内容如下： 1．建立了一种分离嗜铁钩端螺旋菌的选择性方法。 目前，分离嗜铁钩端螺旋菌的最成功方法是双层平板法。其特点是采用了双层平板以及异养细菌-Acidiphilium SJH的加入。尽管这种方法在铁氧化细菌的分离方面非常有效，但双层平板的制备比较繁琐，加入的SJH菌株也并不容易获得。因此，我们根据钩端螺旋菌适宜的生长温度、pH和某些生理生化特性，建立了一种相对简单有效的选择分离性方法，其主要特点是给嗜铁钩端螺旋菌提供有利的生长条件，如低pH(≤1.4)、较高培养温度(≥40℃)和较高氧化还原电位等。基于这种方法，经过连续稀释，我们获得了12株嗜铁钩端螺旋菌纯培养物。此外，还用酵母HJM代替SJH菌株进行了双层平板分离嗜铁钩端螺旋的尝试。 2．以YSK菌株为研究对象，从形态学、生理生化及分子水平等方面进行了鉴定。 钩端螺旋菌属的各个成员之间在形态学和生理学上并没有明显的差异。形态学表明，YSK菌株可能属于一株氧化亚铁钩端螺旋菌。然而，基于以下几种证据，证明YSK菌株属于嗜铁钩端螺旋菌： ① 45℃时的生长能力。 ②与嗜铁钩端螺旋菌典型菌株Fairview的16S rDNA序列的100％的一致性； ③基因组G+C的相对百分含量为58.7％； ④与表3-2中其他菌株间16S-23S间隔区大小的差异； ⑤对黄铁矿高效的浸出能力与对黄铜矿有限的浸出能力。 3．嗜铁钩端螺旋菌gyrB基因的PCR扩增与克隆有关嗜铁钩端螺旋菌gyrB基因的研究还未见相关报道。在本研究中，采用本研究室设计的一对寡核苷酸简并引物，首次报道了嗜铁钩端螺旋菌gyrB基因的PCR扩增与克隆，该基因的克隆为嗜铁钩端螺旋菌分子系统学的研究提供了分子标记。 4．嗜铁钩端螺旋菌的16S rDNA和gyrB基因的序列分析从功能基因gyrB和16S rRNA基因的角度探讨了嗜铁钩端螺旋菌不同菌株间的系统发育关系。结果表明： ①探测到了14个信号位点，其中9个信号位点分布于470-490位点之间。这些信号位点很有可能被用作识别嗜铁钩端螺旋菌不同菌株间的一种分子标记； ②15株嗜铁钩端螺旋菌可分成明显的三组。相似性比较发现，系统发育间的相似性与矿物学特征间很可能存在某种必然的相关性； 5．磁小体的分离与纯化首次通过蔗糖密度梯度离心和SDS处理法，从YSK菌株中分离出了纳米磁性颗粒。透射电境表明，磁性颗粒近似球形，平均直径为44nm。颗粒的大小属于单磁畴结构；能谱分析表明，这种磁性纳米颗粒主要由铁和氧两种元素组成。由此初步推断，这种颗粒就是磁小体。 6．不同铁氧化细菌作用下形成的沉淀差异性分析通过ICP-AES，SEM，XRD和FTIR等方法，在不同温度条件下，对不同铁氧化细菌作用下形成的赭黄色高铁沉淀进行了分析。结果表明，无论是嗜铁钩端螺旋菌DY菌株(L.ferriphium)，还是嗜酸氧化亚铁硫杆菌GF菌株(At. ferrooxidans)作用下形成的沉淀都是黄钾铁矾和黄铵铁矾的混合物。其中，GF作用下形成的沉淀混合物中其黄钾铁矾的含量比DY作用下形成的黄钾铁矾约高出5.53％，而DY作用下形成的沉淀中，其黄铵铁矾的含量比GF作用下形成的沉淀中的黄铵铁矾的含量约高出15.24％。 7．酸性矿坑水中极端嗜酸又能耐受中强碱酵母的分离与鉴定采用平板划线分离法，从江西某铜矿酸性矿坑水中分离出一株极端嗜酸、又能耐受中度碱性条件的异养微生物，命名为HJM菌株。该菌株能在pH1.5-10.0的范围内生长。形态学以及18S rDNA和26SrDNA D1/D2区序列分析表明，HJM菌株属于P. guilliermondii。金属抗性试验表明，该菌株对重金属铜离子的抗性可高达45mmol/L，因此，它的分离为研究极端环境中微生物的抗铜机制提供了材料。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1微生物冶金的定义

1.2微生物冶金的历史与现状

1.2.1微生物冶金的历史

1.2.2微生物冶金的现状

1.2.3微生物冶金的反应机理

1.2.4冶金微生物的研究现状

1.3本论文研究的目的与意义

1.4本论文的主要研究内容

1.5论文课题来源

第二章嗜铁钩端螺旋菌的选择性分离

2.1前言

2.2材料与方法

2.1.1液体样品来源

2.1.2仪器、试剂与培养基

2.1.3培养技术路线

2.1.4结果与分析

2.3本章小结

第三章螺旋状铁氧化细菌的生理特性与分子鉴定

3.1前言

3.2材料与方法

3.2.1菌株与培养基

3.2.2试剂与仪器

3.2.3生理生化特征

3.2.4对黄铁矿的浸出效果

3.2.5对黄铜矿的浸出效果

3.2.6基因组DNA的提取

3.2.7基因组G+C含量的测定

3.2.8 16S rDNA的PCR扩增、克隆、测序与序列分析

3.2.9 16S-23S基因间隔区序列的PCR扩增与电泳分析

3.3结果与讨论

3.3.1生理特征

3.3.2 YSK基因组G+C相对百分含量

3.3.3 16S rDNA PCR产物的序列分析

3.3.4 16S-23S间隔区(IR)PCR产物的电泳分析

3.4本章小结

第四章嗜铁钩端螺旋菌(L.ferriphilum)gyrB基因的PCR扩增、克隆与序列分析

4.1前言

4.2材料与方法

4.2.1菌种和培养条件

4.2.2试剂和引物合成

4.2.3嗜铁钩端螺旋菌YSK基因组DNA的提取

4.2.4 GyrB基因PCR扩增的简并引物的设计

4.2.5 GyrB基因的PCR扩增

4.2.6 PCR产物的克隆与测序

4.3结果与分析

4.3.1 GyrB基因PCR扩增的简并引物的设计

4.3.2 YSK菌株gyrB基因的PCR扩增

4.3.3 GyrB基因的序列分析

4.4讨论

4.5本章小结

第五章嗜铁钩端螺旋菌的遗传多样性分析

5.1前言

5.2材料与方法

5.2.1菌株

5.2.2基因组DNA提取

5.2.3 PCR扩增

5.2.3 PCR产物的克隆与测序

5.2.4序列分析

5.3结果与讨论

5.3.1 16S rDNA序列分析

5.4本章小结

第六章嗜铁钩端螺旋菌(L.ferriphilum)中天然磁性纳米颗粒的分离与纯化

6.1前言

6.2实验材料和方法

6.2.1菌株与生长条件

6.2.2无铁离子细胞的制备

6.2.3超薄切片样品的制备

6.2.4磁性颗粒的提取与纯化

6.2.5透射电镜观察与X-ray能谱分析

6.3结果与讨论

6.3.1扫描电镜下L.ferriphilum的基本形态

6.3.2透射电镜下L.ferriphilum细胞内的磁性颗粒形态

6.3.3磁性颗粒的透射电镜观察与能谱分析

6.4本章小节

第七章不同铁氧化细菌作用下形成的沉淀差异性分析

7.1前言

7.2实验材料与方法

7.2.1仪器

7.2.2菌种

7.2.3培养基与细菌培养条件

7.3沉淀的收集

7.4沉淀的鉴定

7.5实验结果与分析

7.5.1沉淀的化学成分分析

7.5.2沉淀的扫描电镜分析

7.5.3沉淀的XRD分析

7.5.4沉淀的FTIR分析

7.6本章小节

第八章一株分离于酸性矿坑水的异养菌的特性与分子鉴定

8.1前言

8.2材料与方法

8.2.1 HJM菌株的分离与纯化

8.2.2 HJM菌株基因组DNA的提取

8.2.3 18S rDNA和26S rDNA的D1/D2区的PCR扩增

8.2.4 PCR扩增产物的纯化与测序

8.2.5序列分析和系统树的构建

8.2.6 pH值对HJM菌株的生长活性影响

8.2.7 HJM菌株对不同金属离子的抗性特征

8.3结果与分析

8.3.1菌株的形态学特征

8.3.2系统发育分析

8.4讨论

8.5结论

参考文献

致谢

攻读学位期间主要的研究成果