抗性浸矿细菌的选育及抗性机理研究

摘要

本研究选育对重金属等毒性离子具有抗性的高效浸矿菌株，并对抗性菌株对重金属等毒性离子的耐受能力、耐受机理、抗性相关基因及基因差异表达、阴离子对细菌的影响等进行研究。用9K培养基分别以Fe<'2+>及元素S作为能源，对来自江西德兴铜矿、湖北大冶铜矿、广西大厂等多个矿区的矿坑水样本进行了硫化矿浸矿细菌的富集、筛选、驯化、分离纯化，得到能氧化Fe<'2+>及元素S的纯化菌株。提取纯化细菌基因组DNA，通过PCR聚合酶链反应扩增出其16S rDNA片段，测定其16S rDNA片段的核苷酸序列，用BLASTX寸其16S rDNA序列进行比较分析以鉴定选育出的浸矿细菌并构建进化树。在9K培养基中分别加入Cu<'2+>，Ag<'+>，Hg<'2+>，pb<'2+>，Mg<'2+>等重金属离子，通过重铬酸钾滴定法测定培养基中的：Fe<'2+>浓度来确定所分离的菌株在重金属离子抑制情况下对Fe<'2+>的氧化能力变化并筛选出重金属抗性菌株。对抗性菌株的最高耐受能力进行测定并在最高耐受浓度时对Fe<'2+>的氧化能力进行测定和分析。对筛选出的重金属抗性菌株进行紫外诱变以获得具有更高的Fe<'2+>氧化能力及更高重金属离子耐受能力的突变菌株。根据GenBank中的抗性基因序列白行设计抗性基因引物，对实验菌株的重金属抗性基因(抗铜基因、抗砷基因及抗银基因)进行PCR扩增、分子克隆及序列测定，用BLAST搜索工具对上述抗性基因进行分析；对上述抗性基因编码的蛋白质进行分析并构建进化树。在不同铜离子浓度时对抗铜基因差异表达进行分析并进行铜蓝浸矿实验。在以Fe<'2+>为能源的9K培养基中加入不同锌盐，研究在同种阳离子存在时阴离子对浸矿菌株的Fe<'2+>氧化能力的影响。 16S rDNA的序列分析结果表明，本研究的实验菌株均为嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans，简称为At.ferrooxidans)。实验菌株对重金属离子的耐受能力测定结果表明，驯化后筛选出对重金属离子有较高抗性的抗性菌株，对Cu<'2+>，Ag<'+>，Hg<'2+>，Pb<'2+>，Mg<'2+>的最高耐受能力分别为32000 mg/L，240 mg/L，0.9 mg/L，3500 mg/L，22500 mg/L。而野生菌株对上述离子的最高耐受浓度分别为19000mg/L，60 mg/L，0.1 mg/L，400 mg/L，13500 mg/L，说明驯化后抗性菌株对重金属离子的耐受能力明显增强。对具有较高Cu<'2+>抗性和Ag<'+>抗性的抗性菌株进行紫外诱变，获得的突变菌株生长性能稳定，比诱变前菌株及野生菌株具有更高的Fe<'2+>氧化能力和更强的耐受重金属离子性能。其对Cu<'2+>和Ag<'+>的耐受能力分别是野生菌的2-3倍，是驯化菌的1.1-1.3倍。对其抗铜机理及抗银机理研究的结果表明： At.ferrooxidans有抗铜基因AFE0454 copper resistance protein；但没有发现抗银基因silC。在不同铜离子浓度时抗铜基因表达有明显差异。铜蓝浸矿实验发现M26<'＃>的浸矿能力明显高于DC<'＃>和26<'＃>，在CuS浓度为9％时M26<'＃>浸出率可达66.87％。对抗铜基因编码的蛋白质进行分析发现了结构域CopD和PcoD。结构域CopD编码抗铜蛋白，而PcoD的预测产物是铜离子导出蛋白。PcoD与CopD均与Cu<'2+>抗性有关。通过自行设计的抗砷基因引物对另一个抗性基因抗砷基因arsH进行PCR扩增、克隆及测序。结果显示，实验菌株的抗砷基因arsH的序列与模式菌株At. ferrooxidansATCC23270的序列有14个碱基不同。对arsH基因编码的arsH蛋白进行分析，找到了一段以硫作为信号的NADPH(还原性辅酶Ⅱ)依赖的FMN(黄素单核苷酸)还原酶的功能域。推测At.ferrooxidans菌中arsH的功能可能与arsC基因编码的还原酶的氧化还原作用有关。 除了重金属离子At. ferrooxidans菌的影响，阴离子对细菌生长活性及Fe<'2+>氧化能力也有重要影响，其影响的强弱顺序为：SO<,4><'2->≦Cl<'->，不同菌株对阴离子的耐受能力有明显差异。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1前言

1.2嗜酸氧化亚铁硫杆菌的生物学特征

1.2.1形态特征

1.2.2生长条件

1.2.3分类地位

1.3影响嗜酸氧化亚铁硫杆菌生长的因素

1.3.1 pH值的影响

1.3.2温度的影响

1.3.3金属离子的影响

1.4金属离子对细胞毒性作用的机理

1.5细胞对重金属离子的抗性机制研究

1.5.1细胞壁与膜的表面富集

1.5.2细胞外的沉淀和结晶作用

1.5.3与细胞运输有关的抗性机制

1.5.4细胞内的隔离作用和解毒作用

1.5.5金属离子的转化作用

1.5.6重金属离子抗性的抗性基因研究

1.5.7同价阳离子的存在会增加微生物的重金属抗性

1.6嗜酸氧化亚铁硫杆菌驯化诱变育种理论

1.7嗜酸氧化亚铁硫杆菌在细菌浸出中存在的问题和本文的研究内容

第二章嗜酸氧化亚铁硫杆菌的筛选及16S rDNA鉴定

2.1前言

2.2实验材料与方法

2.2.1实验菌株及培养方法

2.2.2实验仪器

2.2.3实验试剂

2.2.4实验菌株的分离及对亚铁的氧化

2.2.5实验菌株对硫的氧化及pH值的变化

2.2.6实验菌株基因组DNA提取

2.2.7基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测

2.2.8实验菌株16S rDNA PCR扩增

2.2.9 PCR扩增产物检测

2.2.10 PCR扩增产物的纯化及测序

2.3实验结果与分析

2.3.1实验菌株分离纯化

2.3.2实验菌株对亚铁及升华硫的氧化能力分析

2.3.3基因组DNA的提取及16S rDNA PCR扩增

2.3.4实验菌株16S rDNA序列分析

2.3.5实验菌株的系统发育分析

2.4本章小结

第三章抗铜嗜酸氧化亚铁硫杆菌的驯化诱变育种及抗铜机理分析

3.1前言

3.2材料与方法

3.2.1实验菌株与培养基

3.2.2菌株的富集

3.2.3筛选天然抗铜能力最高菌株

3.2.4菌株的驯化

3.2.5紫外诱变

3.2.6制作驯化诱变菌与驯化菌生长曲线

3.2.7基因组DNA的提取

3.2.8琼脂糖凝胶电泳检测

3.2.9抗铜基因的引物设计及PCR扩增

3.2.10琼脂糖凝胶电泳检测及PCR反应产物分析

3.2.11用real time PCR进行抗铜基因差异表达分析

3.2.12铜蓝浸出实验

3.3实验结果及分析

3.3.1天然铜抗能力最强菌株的选择

3.3.2 26#菌株最高铜耐受能力测定

3.3.3菌株驯化

3.3.4诱变菌的致死率及生长曲线

3.3.5抗铜基因与AFE0454的比对分析

3.3.6抗铜蛋白的同源蛋白的搜索

3.3.7抗铜蛋白序列分析

3.3.8抗铜蛋白的进化分析

3.3.9嗜酸氧化亚铁硫杆菌抗铜机理的预测

3.3.10 AFE0454基因的差异表达

3.3.11铜蓝浸出实验

3.4讨论

3.5本章小结

第四章银抗性嗜酸氧化亚铁硫杆菌的选育诱变及抗银机理研究

4.1前言

4.2材料与方法

4.2.1菌种来源及富集

4.2.2银抗性菌株的驯化及分离纯化

4.2.3银抗性菌对Fe2+的氧化能力测定

4.2.4银抗性菌对其它重金属离子的耐性实验

4.2.5银抗性菌的16S rDNA鉴定

4.2.6银抗性菌的紫外诱变

4.2.7银抗性菌的抗银机理分析

4.3实验结果

4.3.1菌种来源与富集

4.3.2银抗性菌的驯化及分离纯化

4.3.3 Ag+对DX16和H1的Fe2+氧化能力的影响

4.3.4银抗性菌对其它重金属离子的耐受能力

4.3.5 DX16及H1的16 SrDNA鉴定

4.3.6 DX16的紫外诱变

4.3.7 DX16的抗银机理分析

4.4分析讨论

4.5本章小结

第五章嗜酸氧化亚铁硫杆菌抗砷基因arsH的克隆测序及功能分析

5.1前言

5.2材料与方法

5.2.1实验菌株与生长条件

5.2.2纯化菌株的总DNA提取

5.2.3抗砷基因arsH引物设计及PCR增幅

5.2.4 PCR扩增产物的纯化及克隆

5.2.5 PCR克隆产物的序列分析

5.3实验结果

5.3.1细菌基因组DNA的提取及鉴定

5.3.2细菌arsH基因的扩增克隆及测序

5.3.3 arsH基因表达产物arsH蛋白分析

5.3.4 arsH蛋白的结构分析

5.4讨论

5.5本章小结

第六章阴离子对嗜酸氧化亚铁硫杆菌亚铁氧化活性的影响

6.1前言

6.2材料与方法

6.2.1菌种来源和富集

6.2.2菌种的分离纯化

6.2.3菌种氧化活性研究

6.2.4纯化菌株的16S rDNA鉴定

6.2.5不同金属盐对细菌Fe2+氧化活性的影响

6.3实验结果

6.3.1菌种富集及分离纯化

6.3.2实验菌株对Fe2+的氧化

6.3.3实验菌株对硫的氧化

6.3.4 At.ferrooxidans在不同阴离子锌盐条件下的生长活性

6.4结果分析

6.5本章小结

第七章结论

参考文献

致谢

攻读学位期间主要的研究成果