全反式维甲酸对视网膜母细胞瘤细胞的生长及Cx43基因表达的影响

摘要

第一章 Cx43分子在人正常视网膜及视网膜母细胞瘤(RB)组织中的表达。 目的：探讨细胞间隙连接蛋白(Cx)43在人类正常视网膜组织及视网膜母细胞瘤(RB)组织中的表达规律及其在RB肿瘤的发生、发展中的意义，为RB临床诊断、治疗及预后探索有效的分子指标。 方法：应用免疫组织化学方法检测5例人正常视网膜组织和22例人RB组织中Cx43蛋白的表达及定位，并分别比较正常视网膜组织、RB组织及其瘤旁组织、未分化型与分化型RB组织、局限期及蔓延扩展期肿瘤组织中Cx43蛋白表达的差异。 结果： 1．在人类视网膜组织神经纤维层、神经节细胞层、内核层、视锥视杆细胞层、外界膜及色素上皮层中均有Cx43蛋白表达：在神经纤维层、视锥视杆细胞层、外界膜及色素上皮层中呈全层性表达，而在神经节细胞层及内核层则呈散在点、簇状表达。内界膜、内、外丛状层及外核层未见明显表达。 2．免疫组织化学染色评分：①RB组织中Cx43蛋白染色评分低于正常视网膜组织，二者相比差异有显著性意义(P<0.01)；②蔓延扩展期(Ⅳ～Ⅴ级)组织染色评分显著低于局限期(Ⅰ～Ⅲ级)组织(P<0.05)，而每期内各级组间相比均无显著性差异(P>0.05)；③分化型RB组织中，Cx43蛋白染色评分高于未分化型组织，二者相比有显著性差异(P<0.05)；④在正常视网膜组织、瘤旁组织及RB肿瘤组织中染色评分依次降低，两两相比统计学上有显著性差异(P<0.05)。 结论： 1．人正常视网膜组织中存在Cx43蛋白的固有、广泛表达。 2．人RB组织中Cx43蛋白表达显著降低，其表达水平与肿瘤的蔓延浸润及分化程度呈负相关，而与肿瘤的体积大小无关。 3．Cx413蛋白表达异常可能是RB肿瘤发生、发展中的重要环节和促发因素，检测其表达可能将作为评估肿瘤预后的有意义指标。 第二章全反式维甲酸对体外培养的RB细胞生长的影响。 目的：研究全反式维甲酸(ATRA)对体外培养的RB细胞生物学行为的影响，探索RB肿瘤药物治疗的新方法。 方法：将体外培养的RB细胞随机分为5组：A组：空白对照组；B组：实验对照组(0.1％乙醇溶剂组)；C组：10<'-5> mol/L ATRA作用组；D组：10<'-6> mol/L ATRA作用组；E组：10<'-7> mol//L ATRA作用组。加入药物进行干预后，分别于48h、96h和144h收集各组细胞。应用MTT比色法检测细胞存活率；流式细胞术检测细胞周期的变化及细胞凋亡的发生情况。 结果： 1．ATRA诱导RB细胞增殖减少：与对照组A、B相比，经ATRA作用后，各实验组(C、D、E组)RB细胞均表现生长速度下降，存活率降低，其存活率变化与药物浓度和作用时间呈负相关关系。 2．ATRA诱导RB细胞生长周期和凋亡发生改变：与对照组相比，三实验组G<,0>/G<,1>期细胞比例逐渐增加而G<,2>M、S期细胞比例相应减少，同时，细胞凋亡率也逐渐升高。G<,0>/G<,1>期比例和凋亡率的增加与药物浓度和作用时间呈正向变化关系。 结论： 1．ATRA可抑制体外培养RB细胞的生长增殖。 2．ATRA通过阻滞RB细胞生长周期于G<,0>/G<,1>期并促进其凋亡而抑制细胞生长。在一定范围内，增加药物浓度或延长作用时间可增强此药物效应。 第三章全反式维甲酸对RB细胞Cx43基因及其蛋白表达的诱导作用。 目的：研究ATRA对体外培养的RB细胞Cx413基因及其蛋白表达的影响，探讨ATRA抑制RB细胞生长的作用机制。 方法：同前进行实验分组和药物干预，分别于药物作用后48h、96h和144h收集各组细胞。应用Western blot印迹法检测Cx43蛋白的表达变化；RT-PCR方法检测Cx43mRNA的表达及改变。 结果： 1．经ATRA作用后RB细胞Cx43蛋白表达增高：与对照组相比，各实验组Cx413蛋白电泳条带的光密度比率(ODR)值均增加。药物作用48h后C组、作用96h后D组以及作用144h后E组其ODR值与A组相比统计学上均有显著性差异(P<0.05)。相关性分析结果显示，ODR值的变化与药物浓度和作用时间呈正相关关系。 2．经ATRA作用后RB细胞的Cx43 mRNA表达增加：与对照组相比，各实验组Cx43 mRNA电泳条带ODR值均逐渐升高。ATRA作用48h后C组以及作用96h后D、E两组ODR值与A组相比增高在统计学上均有显著性差异(P<0.05)。相关性分析结果显示，ODR值的增加与药物浓度和作用时间呈正相关关系。 3．ATRA诱导RB细胞中Cx43mRNA及其蛋白表达增高与其抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡在时间上具有同步性。 结论： 1．通过诱导RB细胞Cx43基因表达上调从而抑制细胞增殖并促进其凋亡是ATRA的重要药理机制之一，在一定范围内，增加药物浓度或延长药物作用时间可增强此效应。 2．ATRA调控Cx43基因表达的作用位点可能发生在转录水平。 3．Cx43基因及其蛋白分子是RB肿瘤治疗的有效靶点。 第四章裸鼠眼内RB模型的建立及全反式维甲酸对在体肿瘤的抑制作用。 目的：通过动物模型检验ATRA对裸鼠RB肿瘤生长的影响，为药物的临床应用提供基础性实验依据。 方法：裸鼠眼前房接种体外培养的HXO-RB44细胞建立动物RB模型。将成瘤裸鼠随机分为3组：A：空白对照组，即非治疗组；B：实验对照组，即假治疗组(用0.5％无水乙醇的生理盐水行前房注射)；C：治疗组，用1μg ATRA行眼前房注射。给药频率：每3d注射一次，共治疗3周。每天观察动物眼前房肿瘤形成情况及眼前节局部反应。观察结束时，摘取眼球制作石蜡切片，应用HE染色方法检测眼内肿瘤的生长情况及病理学特征。 结果: 1．前房接种体外培养的HXO-RB414细胞成功建立了BALB/C裸鼠眼部RB肿瘤动物模型，成瘤率为73.3％。 2．动物于接种后6～9d开始成瘤。A组肿瘤生长快，于接种20d后几乎占据整个前房；观察期末(接种后25～30d)，术眼眼球胀大，角膜水肿并新生血管形成。C组肿瘤生长较A组缓慢，接种后20d该组最大肿瘤体积约占前房1/3；观察期末，最大肿瘤体积<3/4前房。该组肿瘤控制率为50％。B组肿瘤体积变化与A组相比无明显差别，肿瘤控制率0％。 3．组织切片病理学检查：A、B组瘤体细胞生长较紧密，前房、晶体后及玻璃体腔均可见瘤细胞生长；C组肿瘤组织相对疏松，瘤细胞分布基本局限于前房，少量见于虹膜后方，但晶体后及玻璃体腔未见瘤细胞侵犯。移植瘤组织学特点与人RB肿瘤组织相似，细胞形态光镜下观察三组间未见明显差别。 结论： 1．前房接种培养的HXO-RB44．细胞建立BALB/C裸鼠RB模型成瘤率较高，是医学研究RB的良好模型。 2．ATRA对动物在体RB移植瘤的生长具有抑制作用，可能是一种极具潜力的RB肿瘤临床治疗用药。

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文摘

英文文摘

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声明

前 言

第一章Cx43分子在人正常视网膜及视网膜母细胞瘤(RB)组织中的表达

材料与方法

结果

讨论

第一章 附图

第二章全反式维甲酸对体外培养的RB细胞生长的影响

材料和方法

结果

讨论

第二章 附图

第三章全反式维甲酸对RB细胞Cx43基因及其蛋白表达的诱导作用

材料与方法

结果

讨论

第三章 附图

第四章裸鼠眼内RB模型的建立及全反式维甲酸对在体肿瘤的抑制作用

材料与方法

结果

讨论

第四章 附图

展望

参考文献

综述 细胞间隙连接蛋白与肿瘤

致谢

攻读博士学位期间发表的论文及奖励