应用血清蛋白质组学方法筛选人肺鳞癌相关抗原——TPI与PRDX6，两种新的肺鳞癌血清标志物

摘要

目前，人类肿瘤抗原的鉴定是一个热点问题，对于肿瘤的诊断和免疫治疗也具有重要意义。在前期研究中，我们把血清蛋白质组方法引入人肺鳞状细胞癌的研究以寻找能诱导肺鳞癌患者发生特异性体液免疫反应的肿瘤蛋白，鉴定出17种至少能与15％的肺鳞癌患者血清发生特异性免疫反应的非冗余肿瘤蛋白，但这些蛋白很少或几乎不与正常血清发生特异性免疫反应。其中，磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase，TPI)和过氧化物氧化还原酶6(peroxiredoxin 6，PRDX6)分别能与25％和30％的肿瘤患者血清发生特异性免疫反应，前期研究结果也发现肺鳞癌患者血清以及肺鳞癌细胞系的培养上清中存在游离状态的 TPI，而PRDX6为已知的一种在血清中存在游离形式的蛋白，这些均提示两种蛋白本身也可能是潜在的肺鳞癌血清标志物。因此，本课题以该两种蛋白为研究对象，对它们作为肺鳞癌血清标志物的可能性以及其抗原性产生的可能机制进行初步探讨。 (一)为了进一步研究 TPI和PRDX6作为肺鳞癌血清标志物的可行性和检验的准确性，用ELISA法对TPI和PRDX6在肺鳞癌患者血清(61例)和其他组血清(正常对照组59例、肺良性疾病组12例、肺腺癌组14例、其他肿瘤组28例)的相对含量进行了检测，其中两种蛋白的相对含量分别用其相对的吸光度值表示，把目的蛋白在正常组的平均吸光度值设为100％，每个样本所对应的目的蛋白的相 对含量表示为目的蛋白在该样本所对应的吸光度与该蛋白在正常对照组吸光度平均值的比值，其中两种蛋白的相对含量分别记作Rtpi和Rprdx6。经单因素方差分析，发现：TPI在肺鳞癌组血清的相对含量均明显高于其他组(P<0.05)；PRDX6在肺鳞癌患者血清中的相对含量高于正常组、肺良性疾病组和其他肿瘤组(P<0.05)，但与肺腺癌患者组无明显统计学差异；两种蛋白的血清相对含量在正常组和肺良性疾病组间无明显差异(P>0.05)。为了初步分析两目的蛋白作为标志物的判别效能，我们把肺鳞癌患者组与非肿瘤组(包括正常和肺良性疾病组)分别作为待区分的两个组，用单个指标或两个指标联合对其进行区分。用Rtpi和Rprdx6分别做临床诊断性能(Receiveroperating characteristic，ROC)曲线，结果表明曲线下面积分别为0.811和0.738，P值均小于0.05，提示二者作为区分两组的指标具有统计学意义。根据ROC曲线，找出两判别指标的最佳临界点(约登指数=敏感性+特异性-1，约登指数最大时判别的符合率最高，此时的临界值为最佳临界点)。可以发现，以Rtpi=1.122为临界点，62.3％(38/61)的肺鳞癌患者Rtpi在临界点以上)，85.9％(61/71)的非肿瘤样本Rtpi在临界点以下，即对肺鳞癌患者正确鉴别的敏感性达到62.3％，特异性为85.9％，总的符合率为75.0％(99/132)，约登指数=0.482；以Rprdx6=1.010为临界点，正确判别肺鳞癌的敏感性和特异性分别为65.6％(40/61)和66.2％(47/71)，判别的总符合率为65.9％(87/132)，约登指数=0.318；当同时用两变量做Bayes判别分析时，统计学结果表明：以判别函数D=-10.265+3.75* Rtpi + 6.030*Rprdx6 (当D>0时，样本被判别为肺鳞癌组，D<0时为非肿瘤组)对样本进行分析，结果有72.1％(44/61)的肺鳞癌样本和84.5％(60/71)的非肿瘤组样本被正确分类，即敏感性和特异性分别达到72.1％和84.5％，约登指数=0.566，交互验证也得到了类似结果。另外，统计学分析表明，PRDX6在血清中的相对含量与肺鳞癌的分化程度升高有一定的正相关(Spearson Rho相关系数=0.313，P<0.05)；而在处于Ⅳ期的肺鳞癌患者，其血清TPI的相对含量明显高于Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期的肺鳞癌患者(P<0.05)。以上研究结果显示：TPI和PRDX6可能是两种新的肺鳞癌血清标志物；PRDX6和TPI分别与肺鳞癌的分化程度和分期有一定的关系，提示二者可成为肺鳞癌的预后诊断的候选标志物。 (二)为探讨两种蛋白抗原性的产生机制，首先用含有针对该两种蛋白特异性抗体的肺鳞癌患者血清作一抗与正常肺组织总蛋白进行2-D和 western blot分析，发现正常组织中的该两种蛋白同样能与阳性的肿瘤患者血清发生免疫反应，表明两种蛋白在肿瘤组织中的抗原性与正常组织中相同，提示它们在肿瘤组织中并未发生异常的翻译后修饰，或者说没有新的抗原表位出现；其次，对30例肺鳞癌组织以及其配对的正常支气管上皮进行针对该两种蛋白的免疫组化分析，结果显示两种蛋白均表达于胞浆，其中，统计学分析表明TPI在肿瘤组织中表达高于其对照正常支气管上皮(P<0.05)，PRDX6的表达在肺鳞癌组与正常对照没有明显差异(P>0.05)。这一结果与ELISA的检测结果共同提示：肿瘤组织中TPI的过表达以及血清中游离形式的 TPI和PRDX6含量的升高可能是诱导产生特异性体液免疫反应的部分原因。

目录

文摘

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论文说明：英文缩略注解

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前言

实验技术路线

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 肺癌标志物的研究进展

致谢

攻读学位期间主要的研究成果