黄芪注射液对人外周血内皮祖细胞的影响及p38MAPK信号传导机制研究

摘要

目的：观察黄芪注射液(AMI)对人外周血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)的数量和迁移、黏附、体外血管生成能力的影响；以及对EPCs增殖、分化及细胞周期的影响。 方法：取健康成人空腹外周血10ml，用密度梯度离心法获取单个核细胞(MNCs)，培养7天后，收集贴壁细胞，贴壁细胞随机分成5组：(1)对照组；(2)AMI各浓度组(共4组)：在培养液中加入终浓度为0.2mg/ml、2mg/ml、20mg/ml、200mg/ml AMI培养24h，其中20mg/ml组观察不同时间(0h、6h、12h、24h、48h)。采用多波长激光共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope，LSCM)鉴定FITC-UEA-I和Dil-acLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPCs；倒置荧光显微镜对每孔EPCs进行计数；流式细胞仪检测细胞表型；改良的Boyden小室检测EPCs迁移能力；黏附能力实验检测EPCs的黏附能力；体外血管生成试剂盒检测EPCs的血管生成能力；MIT比色法检测EPCs的增殖能力；流式细胞仪检测EPCs分化和细胞周期分布。 结果： (1)AMI对外周血EPCs数量的影响：AMI明显增加EPCs的数量，呈一定的量效与时效关系，EPCs数量在2 mg/ml浓度时开始较对照组明显增加，在浓度为20mg/ml时最为显著(P<0.01)；20mg/ml AMI作用6h后，EPCs数量开始明显增加(P<0.05)，24h达到高峰(P<0.01)，48h时略有下降，但仍明显高于对照组(P<0.01)。 (2)AMI对外周血EPCs迁移能力的影响：AMI明显增加EPCs的迁移能力，呈一定的量效与时效关系，2mg/ml浓度时开始明显增强，20mg/ml时最为显著(P<0.01)；20mg/ml AMI作用6h后，EPCs迁移能力开始明显增强(P<0.05)，24h达到高峰(P<0.01)，48h时略有下降，但仍明显高于对照组(P<0.01)。 (3)AMI对外周血EPCs黏附能力的影响：AMI明显增加EPCs的黏附能力，呈一定的量效与时效关系，在2 mg/ml浓度时开始较对照组明显增强(P<0.01)，于20mg/ml时达最大效应(P<0.01)。20mg/ml AMI作用6h后，EPCs黏附能力开始明显增强(P<0.05)，24h达到高峰(P<0.01)，48h时略有下降，但仍明显高于对照组(P<0.01)。 (4)AMI对外周血EPCs体外血管生成能力的影响：AMI显著增强了EPCs的体外血管生成能力，在浓度为20mg/ml时最为显著(P<0.01)，并且形成的管腔样结构也较对照组复杂；20mg/ml AMI作用6h后，EPCs体外血管生成能力开始明显增强(P<0.05)，于24h达到高峰(P<0.01)。 (5)AMI对外周血EPCs增殖的影响：AMI明显增加EPCs的增殖能力，呈一定的量效与时效关系，在2 mg/ml浓度时开始较对照组明显增强(P<0.01)，于20mg/ml时达最大效应(P<0.01)。20mg/ml AM/作用6h后，EPCs增殖能力开始明显增强(P<0.01)，24h达到高峰(P<0.01)，48h时略有下降，但仍明显高于对照组(P<0.01)。 (6)AMI对外周血EPCs细胞周期的影响：AMI2mg/ml浓度开始对EPCs细胞周期分布具有影响，与对照组比较，EPCs在G0/G1期的比例减少(P<0.05)，而S期和G2/M期的比例增高(P<0.05或0.01)，于AMI 20mg/ml时达最大效应(P<0.01)。 (7)AMI对外周血EPCs分化的影响：AMI 2mg/ml浓度开始促进EPCs向内皮细胞系分化，EPCs表达单核细胞表面标志CD14+、CD64+细胞百分比明显降低，而内皮细胞特异性标志vWF+细胞百分比明显升高，(P<0.05或0.01)，在浓度为20mg/ml时达最大效应。 结论： (1)AMI在体外能增加EPCs数量，作用呈浓度和时间依赖性； (2)AMI在体外能改善EPCs的增殖、迁移、黏附、体外血管生成能力，作用呈浓度和时间依赖性； (3)AMI影响EPCs细胞周期分布，使EPCs处于S期和G2/M期的细胞显著增多，而G0/G1期细胞相对比例减少； (4)AMI使EPCs表达单核/巨噬细胞表面标志CD14+、CD64+细胞百分比明显降低，而内皮细胞特异性标志vWF+细胞百分比明显升高，提示AMI可以阻止EPCs向巨噬细胞系分化，促进EPCs向内皮细胞分化。

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文摘

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论文说明:缩略词

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前言

第一章黄芪注射液对外周血内皮祖细胞数量及功能的影响

1.1材料与方法

1.1.1材料

1.1.2方法

1.2结果

1.3讨论

第二章黄芪注射液对高糖培养的人外周血内皮祖细胞p38MAPK信号通路的影响

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2方法

2.2结果

2.3讨论

结论

参考文献

综述 血管内皮祖细胞研究进展

致谢

攻读学位期间主要的研究成果