CTE-RHA复合核酶的构建及抑制HCV RNA复制和相应蛋白表达的研究

摘要

目的:构建实验所需的真核表达载体，特别是人源性tRNA val启动子驱动CTE介导的核酶高效表达载体pPHCV5-CR以及对应的无CTE介导的载体pPHCV5．R；建立HCV Subgenomie Replieon稳定转染和表达的细胞株；探讨核酶和核酶．CTE复合物对丙型肝炎病毒亚基因组的影响，进一步探讨丙型肝炎治疗研究方向。 研究方法: 1、构建相应的核酶载体合成CTE-DNA，设计、构建含tRNAval启动子的核酶和带有CTE的含tRNAval启动子的核酶。 2、建立HCV Subgenomic Replieon稳定转染和表达的细胞株在脂质体lipofectamine<'TM>2000介导下，将含有HCV Subgenes的真核表达质粒pHCV BM4-5导入人肝癌细胞系QSR7701中，经G418筛选抗性克隆，扩大培养，建立转染克隆细胞系。用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法证实转染成功及其蛋白表达。 3、观察四种质粒pPHCV5-R1、pPHCV5-R2、pPHCV5-CR1、pPHCV5-CR2对HCV Subgenomic Replicon稳定转染和表达的细胞株中HCV RNA和相应病毒蛋白表达的影响。 结果: 1、经测序后证实，成功构建相应的核酶载体，为下一步实验奠定基础。 2、经RT-PCR和Western Blot证实，成功建立稳定转染HCVSubgenomic Replicon和表达的细胞株。 3、用构建的普通核酶pPHCV5-R1、pPHCV5-R2和复合核酶pPHCV5-CR1、pPHCV5-CR2瞬时转染含HCV亚基因复制子的稳定转染QSG7701细胞株，48小时后收集细胞进行RT-PCR和WesternBlot，RT-PCR(以β-actin为内对照)结果显示：pPHCV5．CRl转染组未见明显扩增目的条带，pPHCV5-R1转染组可见扩增目的条带，亮度低于未转染组和空质粒转染组；pPHCV5-CR2转染组可见扩增目的条带，亮度低于未转染组和空质粒转染组，pPHCV5-R2转染组可见扩增目的条带，亮度与未转染组和空质粒转染组接近。这些提示：复合核酶(带有CTE)在细胞内的切割靶RNA的效率明显高于普通核酶。普通核酶难以切割的位点，复合核酶能进行有效的切割；普通核酶能进行切割的位点，带CTE-核酶的切割效率明显提高。WesternBlot(以β-actin为内对照)结果显示：应用软件分析各组细胞目的蛋白表达量无明显差异，可能与瞬时转染作用时间短、蛋白表达变化不明显，也可能与实验重复次数少、可用数据少或者检测方法有关。 结论: 新型核酶(带有CTE)在细胞内的切割靶RNA的效率明显高于普通核酶。普通核酶难以切割的位点，带CTE-核酶能进行有效的切割；普通核酶能进行切割的位点，带CTE-核酶的切割效率明显提高。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英汉缩略词对照表

原创性声明及关于学位论文使用授权说明

第一章前言

第二章材料与方法

2.1材料

2.2方法

第三章结果

第四章讨论

第五章结论

参考文献

综述 核酶技术及其基因治疗的研究进展

致谢

攻读学位期间主要研究成果