垫状卷柏化学成分及Selaginellin抗衰老作用与机制研究

摘要

第一章概述 概括了国内外卷柏属植物化学成分和药理活性的研究状况，明确了本课题的研究目标主要为：利用现代色谱分离技术和光谱方法，系统研究垫状卷柏的活性化学成分，重点研究其selaginellin的结构类似成分；在细胞水平上，阐明selaginellin在同型半胱氨酸诱导的血管内皮细胞衰老的作用，以期为动脉粥样硬化等心血管疾病治疗寻找一种新型的先导化合物，为创新药物的研究提供试验依据。 第二章垫状卷柏的化学成分研究 研究背景：垫状卷柏(Selaginella pulvinata Maxim.)为卷柏科卷柏属植物，2005年版《中华人民共和国药典》收载了垫状卷柏S.pulvinata(Hook.et Grev.)Maxim.和卷柏S.tamariscina(Beauv.)Spring两种植物，卷柏具有活血通经之功效。自1971年，Okigawa首次从卷柏(S.tamariscina)中分离出5个黄酮类化合物以来，至今已有34个黄酮类化合物从卷柏属植物中分离鉴定。其它化学成分为苯丙素类、生物碱类、有机酸类、蒽醌类、甾类等。兰州大学Li-Ping Zhang等从S.sinensis中分离出新型碳骨架结构的化合物，命名为selaginellin。 药理研究提示，卷柏属植物的双黄酮类化合物具有抗氧化和抗病毒以及对心血管的作用。亦有文献报道，卷柏属植物具有抗炎和提高免疫能力等作用。本项研究旨在利用现代色谱分离技术和光谱方法，系统研究垫状卷柏的活性化学成分，重点研究其selaginellin的结构类似成分。 方法：运用柱色谱技术和制备高效液相色谱方法分离、纯化化学成分。UV、IR、1H-NMR、13C-NMR、2D-NMR、MS、HRMS等光谱分析方法，鉴定化合物的结构。 结果： (1)从垫状卷柏75％的乙醇提取物中，共分离11个化合物。 (2)经UV、IR、1H-NMR、13C-NMR、2D-NMR、MS和HRMS以及各化合物的理化性质，分别鉴定为β-谷甾醇(β-sitostol)、垫状卷柏胆甾酮(pulvinatadione)、穗花衫双黄酮(amentoflavone)、垫状卷柏双黄酮(pulvinatabiflavone)、橡胶树双黄酮(heveaflavone)、异柳杉双黄酮(Isoeryptomerin)、selaginellin、垫状卷柏三酚(pulvinataphentriol)、垫状卷柏二醇(pulvinatadiol)、垫状卷柏醛(pulvinatahyde)、垫状卷柏二酚(pulvinataphendiol)。 (3)垫状卷柏胆甾酮、垫状卷柏双黄酮、垫状卷柏三酚、垫状卷柏二醇、垫状卷柏醛和垫状卷柏二酚为新化合物。 结论： 1.从垫状卷柏中分离得到11个化合物，其中垫状卷柏胆甾酮(pulvinamdione)、垫状卷柏双黄酮(pulvinatabiflavone)、垫状卷柏三酚(pulvinataphentriol)、垫状卷柏二醇(pulvinatadiol)、垫状卷柏醛(pulvinatahyde)和垫状卷柏二酚(pulvirmtaphendiol)为新化合物。 2.垫状卷柏三酚、垫状卷柏二醇、垫状卷柏醛和垫状卷柏二酚等四个化合物为全新结构的炔酚类化合物。 第三章 Selaginellin对同型半胱氨酸诱导的血管内皮细胞衰老的影响及机制研究 研究背景：动脉粥样硬化(AS)是严重危害人类的健康的主要疾病之一。AS发病原因及机制十分复杂。同型半胱氨酸(Hcy)为含有巯基的氨基酸，能促进动脉粥样硬化形成，增加冠心病患者的病死率，被认为是AS的独立危险因素。 血管内皮功能不全是AS血管早期的一个重要病变特征，被认为是AS发生的始动环节。血管内皮功能不全与内皮细胞的衰老及功能紊乱密切相关。氧化应激被认为是导致细胞衰老的关键因素。此外，细胞抗衰老基因表达的下调也是细胞衰老的重要原因。现已发现多种抗衰老相关基因，其中klotho基因在调控内皮细胞衰老中起重要作用。研究显示，Hcy致AS作用与其诱导内皮细胞衰老有关。 卷柏属于蕨类卷柏科卷柏属植物，具有降血压、降血糖、增强人体免疫功能和抑制氧化应激等作用。Selaginellin为卷柏中提取的一种具有全新结构的单体化合物，体外抗氧化实验结果显示，selaginellin具有较强的抗氧化作用。基于以上研究背景，本实验拟在培养的内皮细胞观察selaginellin对Hcy诱导的细胞衰老的影响并探讨可能涉及的机制。 方法：培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)。MTS法检测细胞活力；以β-半乳糖苷酶活性(染色法)和端粒酶活性(TRAP-银染法)检测细胞衰老；用活性氧荧光试剂盒检测细胞内ROS的生成；实时定量PCR检测细胞内klotho mRNA的表达。 结果： (1)观察10个浓度的selaginellin(3×10-9-10-4 M)对内皮细胞活力的影响。MTS结果显示，当selaginellin浓度低于10-6M时对内皮细胞活力无明显影响，而高于10-6M时能显著降低细胞活力。 (2)Hcy(0.5×10-3M)处理内皮细胞60 h，能显著增加β-半乳糖苷酶活性和降低细胞端粒酶活性，提示Hcy能诱导内皮细胞衰老；预处理selaginellin(10-7，3×10-7和10-6M)1h能显著抑制Hcy诱导的β-半乳糖苷酶活性增加和端粒酶活性的降低，且呈浓度依赖性。 (3)Hcy(0.5×10-3M)处理内皮细胞60 h，能显著增加细胞内ROS水平；预处理selaginellin(10-7，3×10-7和10-6M)1h能浓度依赖性地抑制Hcy诱导的细胞内ROS水平。 (4)Hcy(0.5×10-3M)处理内皮细胞60 h，能显著降低klotho mRNA表达；而selaginellin本身能显著上调klotho mRNA表达，且能逆转Hcy诱导的klotho mRNA表达减低。 结论： Selaginellin能抑制Hcy诱导的内皮细胞衰老，其机制可能与抑制氧化应激和上调klotho表达有关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词及新化合物名称说明

声明

第一章概述

第二章垫状卷柏的化学成分研究

2.1前言

2.2实验部分

2.2.1仪器与试剂

2.2.2提取与分离

2.2.3结构鉴定1

2.2.3结构鉴定2

2.3结果

2.4讨论

2.5结论

第三章selaginellin抑制同型半胱氨酸所致血管内皮细胞衰老及机制研究

3.1前言

3.2材料与方法

3.3结果

3.4讨论

3.5结论

全文结论

参考文献

综述：卷柏属植物活性化学成分及药理作用研究进展

致谢

研究成果

附录新化合物光谱图1

附录新化合物光谱图2