DDAH在调节神经细胞分化及介导药物抗神经细胞凋亡中的作用及机制研究

摘要

一氧化氮(nitric oxide,NO)合酶(nitric oxide synthase,NOS)/NO与神经细胞分化密切相关。二甲基精氨酸二甲胺水解酶(dimethylarginine dimethylaminohydrolase,DDAH)能特异性水解内源性NOS抑制物非对称二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine,ADMA),上调NOS活性。DDAH广泛存在于各种细胞和心血管、神经系统组织中。目前认为其活性降低所致的ADMA代谢减少与多种心血管疾病的发生发展密切相关,是一个新的心血管疾病相关蛋白和药物防治靶点。新近研究发现,舌下运动神经损伤后DDAHmRNA的水平明显升高,同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)可显著降低神经细胞DDAH的表达和活性并增加ADMA的水平,提示DDAH可能与神经系统发育或某些神经系统疾病的发生发展密切相关。
　　本论文将从分子细胞水平系统研究DDAH在神经细胞分化和凋亡中的作用,并探讨DDAH/ADMA通路是否介导3,4,5,6-四羟基(口山)酮和全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,atRA)的抗凋亡作用。
　　主要研究工作如下:在神经生长因子(nerver growth factor,NGF)诱导PC12神经细胞分化的体外模型,利用基因转染技术沉默或过表达DDAH1基因,系统探讨DDAH1调节神经细胞分化的作用及分子机制。结果显示:NGF(50 ng/ml)能诱导神经细胞分化,增加NO水平、DDAH1、nNOS mRNA及蛋白表达,并呈时间依赖性;NGF降低DDAH2mRNA和蛋白表达;NGF对DDAH活性和ADMA水平无明显影响;L-NAME能抑制NGF诱导的神经细胞分化和NO水平,但不影响DDAH1及DDAH2的表达。沉默DDAH1可抑制NGF诱导的神经细胞分化及其标志性蛋白微管相关蛋白(microtubule-associatedprotein2,MAP2)的表达,同时抑制nNOS mRNA的表达;而过表达DDAH1诱导神经细胞分化,增加G0/G1期细胞百分比,增加nNOSmRNA的表达,L-NAME能抑制过表达DDAH1诱导的神经细胞分化。
　　(口山)酮是普遍存在于植物中的一类多酚类化合物。具有强效的抗氧化、抗炎作用。某些(口山)酮单体对血管内皮功能的保护作用与升高DDAH活性从而降低内源性ADMA水平有关。3,4,5,6-四羟基(口山)酮是我校药学院药物化学系合成的新型(口山)酮单体化合物。我室前期工已证明,3,4,5,6-四羟基(口山)酮对缺血心肌及血管内皮具有保护作用,其机制与抑制氧化应激有关。基于Aβ所致神经细胞凋亡与氧化应激密切相关及3,4,5,6-四羟基(口山)酮具有抗氧化特性,本实验采用Aβ25-35诱导PC12神经细胞损伤建立阿尔茨海默病(Alzheimers disease,AD)的细胞模型,研究3,4,5,6-四羟基(口山)酮对Aβ25-35所致PC12细胞凋亡的保护作用,并探讨其机制是否与DDAH/ADMA途径有关。结果显示:10μM Aβ25-35与PC12神经细胞孵育48 h能显著增加细胞凋亡率;Aβ25-35处理PC12细胞3 h后逐渐增加ROS水平和caspase-3活性,抗氧化剂PDTC(5μM)或caspase-3活性抑制剂DEVD-CHO(100μM)能显著抑制Aβ25-35诱导的凋亡;(口山)酮(3,10或30μM)能显著抑制Aβ25-35诱导的细胞凋亡,ROS水平和caspase-3活性的增加。Aβ25-35处理PC12神经细胞6 h后能显著降低DDAH活性和增加ADMA水平,(口山)酮(3,10或30μM)能显著抑制Aβ25-35诱导的上述作用。ADMA浓度和时间依赖性的诱导细胞凋亡;ADMA(10μM)处理PC12细胞3 h后逐渐增加ROS水平和caspase-3活性,抗氧化剂PDTC(5μM)或caspase-3活性抑制剂DEVD-CHO(100μM)能显著抑制ADMA诱导的细胞凋亡。
　　atRA在调控细胞生长、分化、凋亡等生命活动中起重要作用。atRA通过与维甲酸受体(retinoic acid receptor,RAR)和维甲类受体(retinoid X receptor,RXR)结合,从而启动一系列靶基因的转录。其中DDAH2的启动子区含有维甲酸反应元件。新近研究发现,在培养的内皮细胞atRA能上调DDAH2的表达。本研究将探讨CoCl2诱导的PC12神经细胞调亡是否涉及DDAH/ADMA通路及atRA是否通过上调DDAH2表达抑制CoCl2诱导的神经细胞凋亡。结果显示:125μM CoCl2与PC12神经细胞孵育48 h能显著增加细胞凋亡率;CoCl2处理PC12细胞3 h后逐渐增加ROS水平和caspase-3活性;atRA(0.1,1 or 10μM)能显著抑制CoCl2诱导的细胞凋亡、ROS水平与caspase-3的活性的增加;抗氧化剂PDTC(5μM)或caspase-3活性抑制剂DEVD-CHO(100μM)能显著抑制CoCl2诱导的凋亡。CoCl2处理PC12神经细胞6 h后能显著降低DDAH活性和增加ADMA水平;8 h或12 h后分别显著降低DDAH2 mRNA或蛋白的表达;atRA(0.1,1 or 10μM)可显著抑制CoCl2对DDAH活性、表达及ADMA水平的影响。在DDAH2基因被沉默的PC12神经细胞,atRA(0.1μM)不能抑制CoCl2诱导的细胞凋亡;CoCl2处理DDAH2基因被沉默的PC12神经细胞12 h后,atRA(0.1μM)不再抑制CoCl2对ROS水平、caspase-3活性和ADMA水平的影响。

目录

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缩略词

第一章 绪论

1.引言

2.DDAH的基因结构及组织分布

3.DDAH的功能

4.DDAH的生理意义

5.DDAH的病理意义及药物治疗

6.展望

参考文献

第二章 DDAH1调节PC12神经细胞分化及其机制研究

1.前言

2.材料与方法

3.结果

4.附图

5.讨论

6.结论

7.参考文献

第三章 DDAH介导药物抗神经细胞凋亡作用

第一节3,4,5,6-四羟基(口山)酮对Aβ_(25-35)所致PC12神经细胞凋亡的保护作用

1.前言

2.材料与方法

3.结果

4.附图

5.讨论

7.结论

第二节 全反式维甲酸对CoCl_2所致PC12神经细胞凋亡的保护作用

1.前言

2.材料与方法

3.结果

4.附图

5.讨论

6.结论

参考文献

致谢

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