果蝇LRRK2基因编码蛋白的纯化和抗体的初步检测

摘要

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种常见于中老年人的进行性神经变性疾病。其主要临床表现为静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势反射障碍。大部分帕金森病是散发性的。随着α-synuclein、parkin、PINK1、LRRK2等6个PD相关致病基因的克隆，遗传因素在PD发病机制中的作用越来越受到关注。在大约2-13％的迟发型常染色体显性遗传的帕金森病患者和0.5-3％的散发帕金森病患者中检测到LRRK2基因的突变，因此该基因的发现具有重大的意义。果蝇作为研究帕金森病的动物模型，其基因组中含有5个已克隆的PD相关基因。果蝇中有复杂的神经系统，且神经生长和功能在细胞生物学和分子生物学上与人类有极大的相似性。这就使得果蝇成为研究神经生长，功能和神经机能障碍的重要模型。 目的：为了能够深入了解LRRK2基因的功能，了解其在PD发病机制中所起的作用，本实验原核表达和纯化了果蝇LRRK2基因编码的截短蛋白，经诱导并纯化后免疫新西兰雄兔，制备多克隆抗体。 方法：应用PCR的方法从果蝇gDNA中扩增部分LRRK2基因，构建至原核表达载体中，IPTG诱导后分离纯化表达产物并免疫新西兰雄兔，制备抗果蝇LRRK2基因编码蛋白的血清。构建pEGFP-N1-dLRRK2真核表达载体，转染HEK 293T细胞，通过荧光显微镜及Western blotting检测抗体的特异性。 结果：成功构建pGEX-4T-2-dLRRK2原核表达载体。得到了高表达的目的蛋白，经纯化后得到高纯度的GST-dLRRK2融合蛋白。免疫后血清经免疫印迹检测并初步证实了抗体的特异性。 结论：获得了纯化的重组dLRRK2蛋白及多克隆抗体，为在果.蝇模型中研究LRRK2基因的功能奠定了一定的基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

前言

第一章：果蝇LRRK2基因原核表达载体的构建和诱导纯化

1.1材料与试剂

1.2方法

1.3结果

1.4讨论

第二章：果蝇LRRK2基因真核表达载体的构建和抗血清的初步检测

2.1材料和试剂

2.2方法

2.3结果

2.4讨论

结论

参考文献

综述 帕金森病的遗传学研究进展

附录

致谢

攻读硕士学位期间主要研究成果