脓毒症调节性T细胞凋亡对效应T细胞免疫功能的影响及血必净注射液的干预作用

摘要

目的：探讨脓毒症CD4+CD25+Treg凋亡对CD4+效应T细胞免疫功能的影响及血必净注射液的干预作用。 方法： 1.体外实验：断颈处死Wister大鼠，无菌取脾脏，分离单个核细胞。 1)免疫磁珠法(MACS)分离正常大鼠脾脏CD4+T细胞、CD4+CD25-T细胞、及CD4+CD25+Treg，以异硫氰酸荧光素(FITC)标记CD25，流式细胞术(FCM)鉴定细胞纯度，0.4％台盼蓝染色检测细胞存活率。 2)将体外分离的CD4+CD25+Treg分为对照组、抗-CD3/CD28刺激组、抗-CD3/CD28+脂多糖(LPS)刺激组、抗-CD3/CD28+LPS+血净组(5mg/ml)、抗-CD3/CD28+血必净组，于第3天以别藻蓝蛋白(APC)标记Annexin-V及放线菌素D(7-AAD)标记Treg，FCM检测细胞的凋亡率；藻红蛋白荧光素(PE)标记表面标志物叉头翼状螺旋转录因子(Foxp3)和T淋巴细胞毒性相关抗原4(CTLA-4)，FCM检测Foxp3和CTLA-4平均荧光强度；酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-10分泌情况。 3)将各组Treg分别与CD4+CD25T细胞1:1共培养，刀豆素(ConA)刺激68h，噻唑蓝(MTT)比色分析法检测T细胞增殖、ELISA法检测白介素2(IL-2)和可溶性IL-2受体(sIL-2R)及辅助性T细胞(Th)漂移因子干扰素γ(INFγ)/IL-4/IL-17的分泌。 2.体内实验:复制盲肠结扎并穿孔(CLP)大鼠脓毒症模型，体外提取脾脏CD4+CD25+Treg培养过夜。 1)将大鼠分为对照组、假手术组、CLP组，血必净组(4mg/kg)，于第3天检测FOXP3、CTLA-4、凋亡率、IL-10。 2)将各组CD4+CD25+Treg与CD4+CD25-T细胞1:1共培养，ConA刺激68h，检测T细胞增殖、IL-2/sIL-2R、INFγ/IL-4/IL-17。 结果： 1.体外实验 1)Treg凋亡：对照组凋亡率各时间点之间比较无统计学意义；抗-CD3/CD28单克隆抗体诱导Treg凋亡率明显高于同时间对照组，达25-40％。Foxp3、CTLA-4与凋亡率呈负相关；抗-CD3/CD28+LPS刺激组凋亡率高于同时间对照组，稍低于抗-CD3/CD28刺激组，但无统计学意义，而Foxp3、CTLA-4与对照组比较并不随凋亡率增加而降低。 2)对效应T细胞免疫功能的影响: ①T细胞增殖:正常Treg能明显抑制Teff增殖功能，抗-CD3/CD28组和anti-CD3/CD28+血必净组明显高于对照组，抗-CD3/CD28+LPS较对照组明显降低，抗-CD3/CD28+LPS+血必净组与抗-CD3/CD28+LPS组比较有明显差异。②IL-2/sIL-2Ra的分泌:IL-2:抗-CD3/CD28刺激组较对照组明显升高；抗-CD3/CD28+LPS刺激组明显低于对照组和抗-CD3/CD28刺激组；抗-CD3/CD28+LPS+血必净刺激组较对照组、抗-CD3/CD28刺激组、抗-CD3/CD28+血必净刺激组明显降低，而较抗-CD3/CD28+LPS组升高。slL-2Ra:抗-CD3/CD28+LPS组较抗-CD3/CD28组有明显升高，抗-CD3/CD28+LPS+血必净组较抗-CD3/28+血必净组有明显升高。③Th1/Th2/Th17(IFNγ/IL-4/IL-17)漂移:INFγ和IL-4随凋亡增加而升高，抗-CD3/CD28+LPS+血必净组INFγ分泌明显高于抗-CD3/CD28+LPS组，而IL-4则呈相反变化，使IFNγ/IL-4升高；抗-CD3/CD28+血必净组IL-17较抗-CD3/CD28组有明显降低。 2.体内实验 1)Treg凋亡：结果表明对照组Treg凋亡率为12.03±0.89％，假手术组(9.48±2.17％)和对照组比较无明显差异，CLP组凋亡率(5.87±0.44％)低于对照组，而血必净治疗组明显高于其他各组。Foxp3、CTLA-4表达和IL-10分泌功能随凋亡率增加而减少，成负相关。 2)对效应T细胞免疫功能的影响：①T细胞增殖:MTT检测Teff增殖显示CLP组抑制率明显高于对照组，而血必净组抑制率低于CLP组和对照组。②IL-2/sIL-2Ra的分泌:CLP组IL-2分泌低于对照组，slL-2Ra高于对照组；血必净组IL-2分泌高于CLP组，sIL-2Ra低于CLP组。③Th1/Th2/Th17(IFNγ/IL-4/ IL-17)漂移:CLP组INFγ、IL-4和IFNγ/IL-4与对照组比较有明显升高；而血必净治疗组IFNγ、IL-4、IFNγ/IL-4明显高于CLP组；各组IL-17无明显变化。 结论： 1.抗-CD3/CD28能有效诱导脓毒症Treg凋亡，Treg凋亡后细胞接触机制和分泌功能下降。 2.脓毒症Treg对效应T细胞具有强力免疫抑制功能，血必净注射液促进Treg凋亡后可有效改善其对效应T细胞的细胞免疫抑制作用。

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文摘

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论文说明：英文缩略表

声明

前言

第一部分脓毒症凋亡对细胞接触机制及分泌功能的影响及血必净注射液的干预作用

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

4.小结

参考文献

第二部分CD4+CD25+调节性T细胞凋亡对效应T细胞免疫功能的影响及血必净注射液的干预作用

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

4.小结

参考文献

全文总结

附：文献综述Th17：辅助性T细胞的再认识

攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢