鼻咽癌T7噬菌体cDNA文库的构建和鼻咽癌血清自身抗体的筛选

摘要

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一种上皮源性的高发于我国南方及东南亚一带的头颈部恶性肿瘤，在我国广东、广西、福建、湖南、江西尤为突出，据估计全世界鼻咽癌病例中80％发生于我国，年发病率为10-25/10万。由于鼻咽癌起病隐匿，部位特殊，早期症状缺乏特异性，导致早期诊断十分困难，通常在鼻咽癌确诊时，70％以上的患者局部已经高度恶性或扩散到淋巴结，已属于临床中晚期。因此，早期诊断鼻咽癌将极大提高鼻咽癌的治愈率和提高患者预后。 许多蛋白质在肿瘤组织中高表达，这些蛋白质能刺激机体的免疫系统产生抗体，这些自身抗体比肿瘤蛋白质更容易检测，因此将常规检测这些高表达的蛋白质改为检测肿瘤患者体内针对这些肿瘤相关抗原的自身抗体是一种更有效的策略。相当部分的自身抗体作为肿瘤的诊断和预后判断的指标有着潜在的价值，如抗BRD2和α-甲基-辅酶A消旋酶(alpha-methylacy1-CoA racemase，AMACR)自身抗体用于前列腺癌的诊断，抗AnnexinⅪ-A和Grb2相关蛋白自身抗体用于乳腺癌的诊断，抗表皮细胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecule，Ep-CAM)和肌酸激酶B(creatine kinase B，CKB)自身抗体用于卵巢癌的诊断等。目前在鼻咽癌中也发现了一些高表达的蛋白质，如fibronectin、Mac-2BP、plasminogen、和zinc-alpha(2)-glycoprotein(ZAG)等，提示一系列的针对这些高表达蛋白质的自身抗体有可能用于鼻咽癌的诊断和监测，具有很高的应用价值。因此研究针对鼻咽癌特异性或者相关性肿瘤抗原的自身抗体将大大提高鼻咽癌的诊断效率，这些自身抗体有望作为鼻咽癌的肿瘤标志物。首先，探讨了鼻咽癌患者血清中是否存在抗鼻咽癌自身抗原的抗体，为寻找鼻咽癌新的肿瘤标志物提供依据。以Epstein-Barr病毒阴性的鼻咽癌细胞株CNE1细胞为固相抗原板，酶联免疫吸附实验(ELISA)分析其与32例鼻咽癌患者血清和54例正常血清反应的差异性；提取CNE1总蛋白，Western印迹分析其与鼻咽癌患者血清反应是否存在特异性的蛋白质。 EIASA分析结果显示鼻咽癌患者血清平均OD405值(0.904±0.032)明显高于正常人血清平均OD405值(0.736±0.028)(P＜0.01)；Western印迹分析发现鼻咽癌患者血清与正常人血清相比，部分阳性条带位置一致，但条带阳性强度增加，还发现出现了部分新的阳性条带，这些条带可能属于鼻咽癌相关抗原或鼻咽癌特异性抗原。说明鼻咽癌患者血清中存在抗鼻咽癌自身抗原的抗体，这些抗体并非针对Epstein-Barr病毒，为寻找鼻咽癌血清肿瘤标志物提供了依据。 其次，用8例病理确诊的鼻咽癌组织活检标本构建鼻咽癌T7噬菌体cDNA文库，然后再利用来源于鼻咽癌临床分期在Ⅱ-Ⅳ期患者的血清和正常人血清进行生物淘洗，并将生物淘洗获得的22个噬菌体重组蛋白进行免疫印迹和ELISA实验鉴定。随后通过ELISA分析鼻咽癌患者和正常人血清中的5个抗噬菌体重组蛋白自身抗体的水平，ROC分析这些自身抗体作为鼻咽癌诊断标志物的特异性和敏感性。 结果成功构建了鼻咽癌混合组织T7噬菌体cDNA文库，原始库容量为8.0×107pfu/ml，放大后的库容量为3.47×1010pfu/ml，为生物淘洗奠定了基础。利用鼻咽癌患者血清和正常人血清经生物淘洗分离了31个肿瘤相关蛋白质，DNA序列分析显示这31个蛋白质中有22个为独立的与己知或者假定的蛋白质相匹配。说明通过生物淘洗能有效富集与鼻咽癌患者血清发生反应的蛋白质，而这些蛋白质不与正常人血清发生反应，为进一步实验提供了依据。 RT-PCR检测发现BMI-1基因在7株不同的鼻咽癌细胞株中均有不同程度的表达，而在正常鼻咽上皮细胞株NP69中不表达。随后以BMI一1噬菌体重组蛋白与鼻咽癌患者血清进行免疫印迹分析，结果显示在不同的鼻咽癌患者血清中存在不同滴度的抗BMI-1自身抗体，且抗BMI-1自身抗体与BMI-1具有良好的亲合力。进一步ELISA检测鼻咽癌血清中抗BMI-1自身抗体的水平，发现在鼻咽癌患者血清中，抗BMI-1自身抗体平均OD405值为0.791±0.025，而在正常人血清中平均OD40s值为0.488±0.042，统计学分析二者之间具有显著性差异(P<0.01)。ROC分析曲线下面积为0.8044，说明抗BMI-1自身抗体作为鼻咽癌诊断的标志物，具有良好的特异性和敏感性。以鼻息肉患者血清为对照，进一步分析抗BMI-1自身抗体与鼻咽癌临床资料之间的关系，发现抗BMI-1自身抗体与鼻咽癌的转移有密切关系，在原位鼻咽癌患者血清中的水平与鼻息肉患者血清水平相比，具有显著性差异(P<0.01)，提示抗BMI-1自身抗体有可能作为鼻咽癌的早期诊断标志物。在探讨抗BMI-1自身抗体作为鼻咽癌标志物的基础上，又进一步检测了抗CD44、MAGE、fibronectin、HSP70和EBNA-1的自身抗体。CD44、MAGE、fibronectin和HSP70均能与不同的鼻咽癌患者血清发生反应，这种反应强度与正常人血清比较，具有明显差异(P<0.05)。ELISA分析显示抗CD44、MAGE、fibronectin和HSP70的自身抗体具有与4个人噬菌体蛋白良好的亲合力，在鼻咽癌患者血清中的水平明显高于正常人血清和鼻息肉患者血清中的水平(P<0.05)，而在正常人血清和鼻息肉患者血清中的水平无明显差异(P>0.05)，进一步为以抗CD44、MAGE、fibronectin和HSP70的自身抗体作为鼻咽癌的标志物提供了依据。 ROC分析抗CD44、MAGE、fibronectin和HSP70自身抗体作为鼻咽癌标志物的ROC曲线下面积分别为0.7857、0.8922、0.8091和0.84135，而抗EBNA-1自身抗体作为鼻咽癌诊断标志物的ROC分析曲线下面积为0.6110，说明抗CD44、MAGE、fibronectin和HSP70的自身抗体作为鼻咽癌诊断的标志物，其特异性和敏感性均高于抗EBNA-1自身抗体作为鼻咽癌诊断的标志物。 进一步分析抗CD44、MAGE、fibronectin和HSP70自身抗体是否可以作为鼻咽癌早期诊断的标志物，显示鼻咽癌患者血清中抗MAGE自身抗体水平与鼻咽癌的临床分期紧密相关，抗CD44、fibronectin和HSP70的自身抗体的水平也与鼻咽癌的临床分期相关，提示抗MAGE自身抗体可能作为鼻咽癌早期诊断的标志物，这些鼻咽癌患者血清自身抗体的水平可以用来预测鼻咽癌的临床分期。 总之，通过本研究，证实了在鼻咽癌患者血清中存在针对鼻咽癌组织的自身抗体，这些自身抗体有可能作为鼻咽癌的肿瘤标志物，用于鼻咽癌的早期诊断或者预后判断，但是由于这些自身抗体也存在于其它肿瘤患者血清中，所以难以单独用于鼻咽癌的诊断，而将多个自身抗体联合起来用于鼻咽癌的早期诊断是有可能的。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文对照

声明

前言

1、鼻咽癌肿瘤标志物

2、肿瘤自身抗体

2.1肿瘤自身抗体用于早期诊断的依据

2.2肿瘤自身抗体存在的证据

2.3肿瘤自身抗体产生的机制

2.4肿瘤自身抗体筛选策略

技术路线

第一章鼻咽癌患者血清自身抗体的检测

1.1材料与方法

1.1.1材料

1.1.2实验方法

1.2结果

1.2.1 Epstein-Barr病毒在鼻咽癌细胞株中的表达

1.2.2鼻咽癌患者血清OD405值检测

1.2.3鼻咽癌患者血清中的肿瘤标志物分析

1.3讨论

第二章鼻咽癌组织T7噬菌体cDNA文库的构建与筛选

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2方法

2.2结果

2.2.1鼻咽癌组织mRNA的分离

2.2.2鼻咽癌组织T7噬菌体cDNA文库的构建

2.2.3噬菌体文库原始滴度的测定

2.2.4噬菌体文库的扩增

2.2.5鼻咽癌组织T7噬菌体cDNA文库的鉴定

2.2.6噬菌体文库的生物淘洗

2.2.7重组噬菌体表达蛋白的分析

2.3讨论

第三章鼻咽癌血清自身抗体的初步研究

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2结果

3.2.1 RT-PCR检测BMI-1基因在鼻咽癌细胞株中的表达

3.2.2鼻咽癌患者血清中抗BMI-1的自身抗体的检测

3.2.3抗BMI-1自身抗体亲和力的检测

3.2.4 ELISA检测鼻咽癌患者血清中的针对BMI-1的自身抗体

3.2.5免疫印迹检测鼻咽癌患者血清中抗CD44、MAGE和HSP70的自身抗体

3.2.6抗CD44、MAGE和HSP70自身抗体亲和力的检测

3.2.7 ELISA分析鼻咽癌血清中抗CD44、MAGE、fibronectin和HSP70自身抗体

3.2.8 ROC分析抗CD44、MAGE、fibronectin和HSP70自身抗体作为鼻咽癌诊断标志物的分析

3.2.9抗CD44、MAGE、fibronectin和HSP70自身抗体与鼻咽癌临床分期之间的关系

3.3讨论

结论

参考文献

综述 自身抗体——肿瘤新的早期诊断标志物

致谢

攻读学位期间主要的研究成果