长春地辛群体药代动力学：ABCB1遗传多态性和表观遗传学差异的影响

摘要

长春地辛，是半合成的长春碱衍生物，广泛应用于临床恶性肿瘤包括血液系统恶性肿瘤的治疗。ABCB1是一种重要的药物转运蛋白，与许多恶性肿瘤的预后相关。体外研究已表明长春地辛是ABCB1的底物。ABCB1的基因多态性可以影响其表型，表遗传因素也可能参与了ABCB1表达的调控。但是，目前没有ABCB1基因多态性对长春地辛体内药代动力学影响的报道，也没有表遗传因素对任何药物体内药代动力学影响的报道。同时，由于经典的药代动力学研究需要进行较密集的血样采集，很难在临床上进行，特别对于许多血液病患者，反复多次采血的依从性很差。因此，进行了以下研究：(1)采用了群体药代动力学的方法，通过有限的采血点建立长春地辛群体药代动力学模型，估算群体参数值，再结合Bayesian反馈法，较准确地计算出个体参数。(2)比较3种ABCB1主要单核苷酸多态性C3435T、G2677T/A、C1236T及由它们构成的单倍体型在中国汉族健康人群和淋巴系统恶性疾病患者中的分布，观察不同基因型之间启动子区域甲基化程度的差异。(3)研究C3435T、G2677T/A、C1236T单核苷酸多态性和单倍体型对长春地辛群体药代动力学的影响。(4)初步探讨ABCB1启动子区域甲基化程度与长春地辛群体药代动力学的影响。 为了完成本实验，应用了以下研究方法： 1.建立长春地辛静脉推注的群体药代动力学模型 100名在中南大学湘雅医院住院治疗的中国汉族血液恶性肿瘤患者参加了本试验。其中男性患者62名，女性患者38名。患者均单剂量给与长春地辛3mg快速静脉推注，推注结束后开始计时，依据计算机预先生成的采血时间表在0、5min，20min，1小时、3小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时10个采血点中随机采取2-3个时间点的静脉血样。HPLC-MS/MS法检测血浆长春地辛浓度。使用非线性混合效应模型(NONMEM)进行计算，Bayesian回归法推算个体药代动力学参数。 2.ABCB1单核苷酸多态性基因型和单倍体型的测定 使用聚合酶链式反应-限制性片断长度多态性法(PCR-RFLP)测定ABCB1的3个主要的单核苷酸多态性C3435T、G2677T/A，C1236T突变，应用PHASE2.0重构单倍体型。 3.ABCB1启动子区域甲基化分析 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(COBRA)进行启动子区域甲基化分析。1-2μgDNA稀释至50μl，变性后亚硫酸氢钠硫化处理，使DNA中未甲基化的C转化为T，PCR扩增，限制性内切酶酶切后非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，EB染色后进行灰度扫描。 4.统计方法 所有统计均使用SPSS13.0软件进行数据的分析。不同基因型组间基因型分布频率差异采用卡方检验。Hardy-Weinberg检验采用卡方检验。不同基因型之间的药代动力学参数和启动子区域甲基化程度差异使用Kruskal-Wallis检验和Mann-Whitney U检验。由于不能完全满足双正态分布，药代动力学参数与启动子区域甲基化程度的相关分析使用Speramen法。P<0.05被认为有统计学意义。通过以上实验，本课题的主要研究结果如下： 1.建立了长春地辛群体药代动力学模型，表观清除率(CL/F)、半衰期(T1/2)、表观分布容积(V)和曲线下面积(AUC)等药代动力学参数的均值分别为0.381±0.108L/h，22.8±10.4h，170.12±69.29L，149±67μg/L.h-1。除CL/F较报道稍高外，其余药代动力学参数基本与I期临床研究报道一致。 2.在中国汉族恶性淋巴系统肿瘤患者中，ABCB1的C3435T单核苷酸多态性的野生型纯合子CC的频率为34％，突变型纯合子TT的频率为22％，突变型杂合子CT的频率为44％；ABCB1的C1236T单核苷酸多态性的野生型纯合子CC的频率为10％，突变型纯合子TT的频率为48％，突变型杂合子CT的频率为43％；ABCB1的G2677T/A单核苷酸多态性的野生型纯合子GG的频率为18％，突变型纯合子中TT的频率为16％，TA的频率为9％，AA的频率为2％，突变型杂合子GT的频率为42％，GA的频率为13％。在单倍体型分析中，12中可能的单倍体构型组合中共有9种单倍体型被重构，其中TTT、FGC、CGC和CAC占整个中国汉族人群的90％以上。与健康人比较，淋巴系统恶性肿瘤患者的基因频率和单倍体型频率没有显著性差异。 3.健康志愿者和患者间甲基化程度存在显著性差异。发现C3435T和G2677T/A不同基因型受试者中启动子区域甲基化程度具有显著性差异，C1236T不同基因型之间启动子区域甲基化程度没有显著性差异。 4.在ABCB1基因型对长春地辛群体药代动力学的影响研究中，发现长春地辛药代动力学参数CL/F个体间存在3.5倍的差异，但是ABCB1的3个主要的单核苷酸多态性C3435T、G2677T/A，C1236T各基因型和单倍体型之间的长春地辛药代动力学参数均没有发现统计学差异。 5.在ABCB1启动子区域甲基化程度对长春地辛群体药代动力学的影响研究中，发现ABCB1启动子区域甲基化程度与CL/F成正相关(rs=0.365)，与AUCrs=-0.366)、Vd(rs=-0.339)存在负相关。而与T1/2不存在相关性。 从本试验中可以得出以下结论： 1.中国汉族血液恶性肿瘤患者中长春地辛的药代动力学符合3室模型和一级动力学消除。本长春地辛群体药代动力学模型可用于临床药代动力学研究和血药浓度监测，特别是当采样受到限制，不能使用经典的药代动力学方法时。 2.ABCB1 3个主要的单核苷酸多态性C3435T、G2677T/A，C1236T各基因型和单倍体型与淋巴系统恶性肿瘤发病无关。中国汉族健康志愿者中ABCB1 3个主要的单核苷酸多态性C3435T、G2677T/A，C1236T各基因型和单倍体型频率与淋巴系统恶性肿瘤患者的基因频率和单倍体型频率相似。ABCB1基因启动子区域甲基化程度与C3435T和G2677T/A基因型存在相关性，但是其机制和临床意义还需要进一步探讨。 3.ABCB1 3个主要的单核苷酸多态性C3435T、G2677T/A、C1236T和单倍体型对长春地辛人体内药代动力学参数没有影响。ABCB1启动子区域甲基化程度与长春地辛群体人体内部分药代动力学参数存在相关性，可能为长春地辛药代动力学参数个体差异的原因之一。

目录

文摘

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声明

前言

第一章中国汉族血液恶性肿瘤患者中长春地辛静脉推注的群体药代动力学模型和少量采样方法的建立

1研究背景

2材料与方法

3结果

4讨论

5小结

参考文献

第二章中国汉族健康志愿者与恶性淋巴肿瘤患者中ABCB1基因多态性频率比较和基因型之间启动子区域甲基化程度的差异

1研究背景

2材料和方法

3结果

4讨论

5小结

参考文献

第三章ABCB1基因型对长春地辛群体药代动力学的影响

1研究背景

2材料和方法

3结果

4讨论

5小结

参考文献

第四章ABCB1启动子区域甲基化程度对长春地辛群体药代动力学的影响

1研究背景

2材料和方法

3结果

4讨论

5小结

参考文献

结论

综述 影响多药耐药蛋白的遗传和表遗传因素及临床应用

致谢

攻读学位期间主要成果