非对称二甲基精氨酸在肺动脉高压血管重构中的作用

摘要

研究背景： 肺动脉高压(PAH)是临床常见疾病之一，以肺血管高收缩性和血管重构为主要病理特征。血管平滑肌细胞(VSMC)过度增殖是引起血管重构的病理基础。一氧化氮(NO)是最重要内源性血管舒张因子之一，在维持血管正常生理功能中起关键作用。非对称二甲基精氨酸(ADMA)是内源性一氧化氮合酶(NOS)抑制物，可抑制NOS活性，减少NO生成，被认为是一种新的心血管疾病危险因子。体内ADMA主要由二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)水解代谢。动物实验和临床研究发现，肺动脉高压时，DDAH表达下降，ADMA浓度上升，提示其可能参与PAH的形成。Rho激酶(ROCK)是影响VSMC收缩、增殖、迁移的重要激酶，在肺血管重构中发挥重要作用。ADMA能激活内皮细胞ROCK影响内皮细胞活力揭示ADMA与ROCK之间存在关联。因此，本实验旨在研究ADMA在肺血管重构中的作用并探讨其作用是否与激活ROCK途径有关。 方法： 1、动物实验 220g～250g的Sprague-Dawley大鼠，单次腹腔注射野百合碱(moncrotine，MCT，60mg/kg)建立肺动脉高压模型。对照组腹腔注射同等剂量生理盐水。28d后在水合氯醛麻醉下，颈动脉插管取血，迅速开胸，分离心脏和肺脏。检测血浆ADMA(高效液相色谱，HPLC)、TGFβ1(ELISA)水平，分离心脏右心室、左心室+室间隔，称重计算右心室/(左心室+室间隔)质量比。右肺中叶以4％多聚甲醛固定、切片、HE染色观察肺血管重构情况；提取右肺下叶组织总RNA，Real-time PCR检测DDAH2、ROCK1及Transforming growth factor βl(TGFβ1)mRNA水平。 2、细胞实验培养原代肺动脉平滑肌细胞(PASMC)，以ADMA(3，10，30 μM)孵育24h，另有一组同时给予ADMA(30μM)和ROCK特异性抑制剂Y-27632(10μM)处理24 h。噻唑蓝比色(MTT)法和Luminescent分析法检测细胞增殖；Real-Time PCR检测细胞ROCKmRNA水平。 结果： 1、野百合碱诱导大鼠肺动脉高压形成，右心室肥厚明显，肺小动脉显著增厚；血浆ADMA浓度明显升高，与血管重构密切相关；肺组织中DDAH2表达显著下调，ROCK1表达显著增高。 2、ADMA(3，10 and 30μM)孵育PASMC 24h明显促进细胞增殖，呈剂量依赖性。同时给予ROCK特异性抑制剂Y-27632(10 μM)能抑制ADMA(30μM，24h)诱导的ROCK1mRNA水平的上调和VSMC增殖。 结论： 1、在野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠，内源性ADMA水平增加可能是促进肺血管重构的重要因素。 2、ADMA促进肺动脉平滑肌细胞增殖涉及ROCK信号转导途径。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

声明

第一章前 言

第二章材料与方法

2.1 材料

2.2动物实验

2.2.1动物造模及分组

2.2.2血浆及组织标本收集

2.2.3血浆TGFβ1浓度测定

2.2.4血浆ADMA浓度测定

2.2.5组织标本总RNA提取及逆转录

2.2.6荧光定量实时PCR

2.3 细胞实验

2.3.1原代肺动脉平滑肌细胞培养

2.3.2细胞鉴定

2.3.3细胞增殖实验分组

2.3.4噻唑蓝比色(MTT)法

2.3.5 Luminescent cell viability分析法

2.3.6细胞RNA提取

2.3.7 RNA逆转录成DNA

2.3.8荧光定量实时PCR

2.4 统计分析

第三章结果

3.1右心室/(左心室+室间隔)比例

3.2肺小动脉HE染色及分析

3.3血浆TGFβ1浓度

3.4血浆ADMA浓度

3.5肺脏DDAH2mRNA水平

3.6肺脏ROCK1mRNA水平

3.7原代肺动脉平滑肌细胞鉴定

3.8 ADMA诱导PAVSMC增殖及被Y-27632抑制(MTT)

3.9 ADMA诱导PASMC增殖及被Y-27632抑制(Luminescen Cell Viability Assay)

3.10 ADMA对ROCK基因表达的影响

第四章讨 论

第五章结 论

参考文献

综述：二甲基精氨酸二甲胺水解酶与心血管疾病

1.DDAH的生物学特性

1.1 DDAH的表达与分布

1.2 DDAH活性及其测定

1.3 DDAH活性的调节机制

2.DDAH的生物学作用

2.1调节NO生成

2.2促进血管新生

2.3促进细胞分化

2.4调节细胞增殖与凋亡

3.DDAH/ADMA系统与心血管疾病

3.1 DDAH/ADMA与动脉粥样硬化

3.2 DDAH/ADMA与肺动脉高压

3.3 DDAH/ADMA与高血压

4.DDAH与药物治疗

5.结语

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间主要研究成果