多巴胺对大鼠体外培养视皮层神经元γ-氨基丁酸激活电流作用的研究

摘要

第一章探求视皮层神经元的最佳分离和培养方法 目的:通过原代培养新生大鼠视皮层神经元，探求视皮层神经元的最佳分离和培养方法，提高原代培养神经元的纯度及活性，为视皮层相关性眼病的临床基础研究提供实验模型。 方法:取出生后1～3d清洁级SD大鼠，定位视皮层，以酶消化法分离视皮层神经元，应用含10％新生牛血清、10％F-12 NutrientMixtures的DMEM培养基进行接种培养，含2％B-27 Serum-Free Supplements的Neurobasal Medium进行维持培养。利用尼氏染色进行神经元鉴定。 结果:接种1h后大部分细胞已贴壁。2～3h后见少数细胞长出较短的突起。24h后长出突起的神经元数目逐渐增多，突起长度增加。10d后神经元突起长度可达自身胞体直径的10倍以上，并形成复杂的网络结构。15～16d后神经元开始发生退化。镜下非神经元细胞形态与神经元存在差别并易区分。6d后非神经元细胞逐渐减少。神经元经尼氏染色后胞浆呈蓝紫色，尼氏小体颗粒状，结构清晰。非神经元细胞胞浆基本不着色，胞核淡紫色圆形，核仁清晰可辨。神经元比例为40％～50％。 结论: 1.培养视皮层神经元生长良好，活性佳，易与非神经元细胞鉴别。 2.尼氏染色显示培养神经元比例约为40％～50％。 第二章培养大鼠视皮层神经元γ-氨基丁酸激活电流的特点 目的:探讨培养大鼠视皮层神经元γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)-激活电流的特点。 方法:选择培养第11～14d形态典型、状态良好的视皮层神经元，应用膜片钳技术以全细胞模式记录其GABA-激活电流(IGABA)。 结果: 1.大部分受检细胞(85.42％，41/48)对GABA敏感。同一细胞IGABA幅值与GABA浓度呈剂量依赖关系：随浓度增大IGABA幅值逐渐增大。不同细胞上予以相同浓度的GABA，IGABA幅值不同。 2.IGASA具有明显的去敏感现象，应用双刺激法检测IGABA的去敏感时程，发现GABAA受体的去敏感恢复时间为5min。 3.IGABA可被GABAA受体的选择性拮抗剂荷包牡丹碱阻断，可被特异性GABAA受体激动剂蝇覃醇(Muscimol)模拟。 4.IGABA反转电位为0mV左右，接近CI-平衡电位。 5.IGABA幅值稳定，比较各时间点(0～30min)测得的变化率，差异无显著性。将各时间点的结果总和得到IGABA平均变化率为4.51±3.02％。 结论: 1.大部分培养大鼠视皮层神经元对GABA敏感。 2.IGABA具有剂量依赖性及明显的去敏感现象。 3.IGABA幅值稳定，平均变化率为4.51±3.02％。 第三章多巴胺对培养大鼠视皮层神经元GABA-激活电流的作用 目的:探讨多巴胺(Dopamine，DA)对培养大鼠视皮层神经元GABA-激活电流的作用。 方法:选择培养第11-14d形态典型、状态良好的视皮层神经元，应用膜片钳技术以全细胞模式记录IGABA。在不同时间点于细胞外液中分别加入不同浓度的DA、D1受体选择性激动剂SKF38393、D2受体选择性激动剂Quinpirole，联合应用SKF38393与D1受体拮抗剂SCH23390、SKF38393与Quinpirole观察IGABA的变化。 结果: 1.IGABA对DA存在剂量及时间依赖效应。预加DA可减小IGABA，加入10μM～500μMDA后，ICABA的变化率与对照组相比差异有显著性，其中50μM的剂量产生的作用最为显著。DA作用2～6min后，IGABA的变化率与对照组相比差异有显著性。抑制作用一般在预加4min后达到稳定。 2.IGABA对D1受体选择性激动剂SKF38393存在剂量及时间依赖效应。预加SKF38393可减小IGABA，加入1μM～100μM SKF38393后，IGABA的变化率与对照组相比差异有显著性，剂量超过10μM后作用基本趋于稳定。10μM SKF38393作用3～6min后与对照组相比差异有显著性。抑制作用一般在预加4min后达到稳定。应用D1受体拮抗剂SCH23390(10μM)可显著减小SKF38393(10μM)对IGABA的抑制作用，差异有显著性。 3.单独应用10μM、100μM、1mM D2受体选择性激动剂Quinpirole 5min、10min后对IGABA无明显作用。 4.与单独应用SKF38393(10μM)相比，联合应用SKF38393(10μM)及Quinpirole(10μM)4～6min后对IGABA的抑制作用减弱，在5min组差异有显著性。 结论: 1.IGABA可被DA、D1受体选择性激动剂SKF38393抑制，其抑制程度与二者存在剂量及时间依赖性。D1受体拮抗剂SCH23390可显著减小SKF38393对IGABA的抑制作用。 2.单独应用D2受体选择性激动剂Quinpirole对IGABA无明显作用。 3.SKF38393及Quinpirole联合应用对IGABA的抑制作用较单独应用SKF38393减弱。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文对照

声明

前言

第一章：大鼠视皮层神经元原代培养

1.1材料与方法

1.1.1实验材料

1.1.2方法

1.2结果

1.2.1培养大鼠视皮层神经元形态特点

1.2.2神经元鉴定及其比例

1.3讨论

1.3.1神经元体外培养的方法学讨论

1.3.2视皮层神经元体外培养的意义

1.4 小结

第二章：培养大鼠视皮层神经元GABA-激活电流的特点

2.1材料和方法

2.1.1实验材料

2.1.2方法

2.1.3数据分析及统计学处理

2.2结果

2.2.1 IGABA的形态及特性

2.2.2 GABA受体拮抗剂及激动剂对IGABA的影响

2.2.3 IGABA的稳定性

2.3讨论

2.3.1方法学特点讨论

2.3.2培养视皮层神经元IGABA的特点

2.3.3研究培养视皮层神经元IGABA的意义

2.4 小结

第三章：多巴胺对培养大鼠视皮层神经元GABA-激活电流的作用

3.1材料和方法

3.1.1实验材料

3.1.2方法

3.1.3数据分析及统计学处理

3.2结果

3.2.1不同浓度DA对IGABA的影响

3.2.2不同亚型DA受体激动剂对IGABA的的影响

3.3讨论

3.3.1 DA对GABA的作用

3.3.2功能意义

3.4 小结

结论

参考文献

综述 γ-氨基丁酸与视觉发育的可塑性

致谢

攻读学位期间主要的研究成果