hMLH1基因启动子甲基化与非小细胞肺癌细胞顺铂耐药方面的研究

摘要

目的： 观察A549细胞及A549/DDP细胞hMLH1基因的表达及其甲基化状态的关系，并用去甲基化试剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-Aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-CdR）干预体外培养的非小细胞肺癌耐药细胞A549/DDP，观察是否能通过去甲基化作用恢复hMLH1基因表达从而逆转A549/DDP细胞对顺铂的耐药。 方法： 1.选用肺腺癌耐药细胞株A549/DDP作为研究对象，以肺腺癌细胞株A549作为对照，RT-PCR测试A549细胞及A549/DDP细胞的hMLH1基因表达情况，及5-Aza-CdR干预A549/DDP细胞后hMLH1基因表达情况。 2.甲基化特异性PCR检测A549细胞及A549/DDP细胞的hMLH1基因甲基化状态，及5-Aza-CdR干预A549/DDP细胞后hMLH1基因甲基化状态。 3.MTT试验观察不同浓度的顺铂对A549/DDP细胞5-Aza-CdR干预前后细胞抑制率的影响。 4.Hoechst33258染色观察5-Aza-CdR干预前后顺铂对A549/DDP细胞凋亡细胞凋亡的形态学变化。 5.流式细胞仪（FCM）检测5-Aza-CdR干预前后不同浓度的顺铂对A549/DDP细胞凋亡指数、凋亡的水平。 结果： 1.hMLH1 mRNA在A549细胞中的表达较在A549/DDP细胞中高，平均OD比值分别为0.7766±0.0405，0.2059±0.0093（P<0.05），经5-Aza-CdR干预A549/DDP细胞后hMLH1 mRNA表达增高，在0-10μmol/L范围内呈浓度依赖性，10μmol/L与20μmol/L5-Aza-CdR作用时其OD比值分别为0.7989±0.0427，0.7802±0.0411，比较无显著差异（P>0.05）。 2.A549细胞hMLH1基因为非甲基化状态，而耐药株A549/DDP细胞为部分甲基化状态，A549/DDP细胞经5-Aza-CdR脱甲基作用后hMLH1基因呈非甲基化状态。 3.MTT实验检测细胞增殖，分为A549组、A549/DDP组、经10μmol/L5-Aza-CdR干预后的A549/DDP组，三组经不同浓度顺铂48小时作用后的IC50值分别为4.719±0.712μmol/L，30.069±1.813μmol/L，6.921±0.620μmol/L.10μmol/L5-Aza-CdR可增强A549/DDP细胞对顺铂的化疗敏感性，但仍不及其亲本细胞株A549细胞对顺铂的敏感性，其差异有统计学意义（P<0.05）。 4.5-Aza-CdR干预后的A549/DDP细胞经顺铂作用后，比单用顺铂抑制A549/DDP细胞的凋亡形态学改变明显，凋亡小体以及核固缩现象增多。 5.流式细胞仪检测细胞凋亡水平，分为A549/DDP组、经10μmol/L5-Aza-CdR干预后的A549/DDP组，两者自发凋亡率分别为（1.41±0.10）％，（1.67±0.18）％，比较无显著性差异（P>0.05）。经顺铂作用后后者凋亡率较前者增高，有显著性差异（P<0.05）。 结论： 1. hMLH1基因甲基化可能参与了非小细胞肺癌耐药细胞株A549/DDP的顺铂耐药； 2.去甲基化药物5-氮杂-2’-脱氧胞苷能抑制hMLH1基因甲基化，恢复hMLH1基因表达，并能增强顺铂对A549/DDP细胞的细胞增殖抑制和凋亡。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一章前言

第二章材料和方法

第三章实验结果

第四章讨论

第五章结论

参考文献

综述 DNA错配修复基因hMLH1与肿瘤及化疗耐药

致谢

攻读学位期间主要研究成果