高糖高脂环境下血小板活化因子在内皮细胞与系膜细胞相互关系中作用的研究

摘要

第一章糖、脂对内皮细胞和系膜细胞相互作用的影响 目的：本研究观察在高浓度D-葡萄糖和溶血卵磷脂(LPC)作用下，系膜细胞单独培养及内皮细胞和系膜细胞共同培养纤维连接蛋白(Fn)、IV型胶原(Col IV)、血小板活化因子(PAF)、系膜细胞血小板活化因子受体( PAF-R)基因表达的变化，探讨内皮细胞生成的PAF是否在内皮细胞与系膜细胞相互关系中起作用，从而促进ECM(Fn，Col IV)的分泌。 方法：分别建立系膜细胞单独培养(单培养)和内皮细胞与系膜细胞共培养模型(共培养)。单培养和共培养模型分为：对照组、甘露醇组、高糖组、高脂组、高糖高脂联合培养组、高糖+高脂+BN52021(PAF-R受体拮抗剂)组。ELISA法测细胞上清液Fn，CoIIV、PAF。实时荧光定量PCR检测系膜细胞PAF-R mRNA表达。 结果：1.在共培养和单培养条件下：与对照组、甘露醇组相比，高糖组、高脂组、高糖高脂联合培养组细胞上清液Fn、Col IV含量均升高(均P<0.05)，以高糖高脂联合培养组最明显(P<0.05)，而这种作用可被BN52021所抑制(P<0.05)。2.在共培养和单培养条件下：与对照组和甘露醇组相比，高糖组、高脂组、高糖高脂联合培养组细胞上清液PAF和系膜细胞PAF-R基因表达均升高(均P<0.05)，以高糖高脂联合培养组最明显(P<0.05)，BN52021不能抑制高糖高脂联合刺激的细胞上清液PAF和系膜细胞PAF-R基因表达升高；各种培养条件下，共培养组上清液PAF均较单培养组升高(均P<0.05)，共培养和单培养系膜细胞PAF-R基因表达均无差别。 结论： 1.高糖高脂联合作用系膜细胞分泌ECM( Fn和Col IV)更明显。 2.高糖高脂条件下，内皮细胞与系膜细胞间存在异常的相互作用，从而促进系膜细胞ECM分泌。 3.高糖高脂联合培养下，内皮细胞分泌PAF增加，从而促进系膜细胞ECM(Fn、Col IV)分泌，高糖高脂联合培养刺激的ECM分泌增加部分与PAF有关。 4.高糖高脂联合培养可促进系膜细胞PAF-R表达，使PAF的生物效应进一步放大。 第二章高糖高脂条件下PAF对系膜细胞的作用机制 目的：通过观察在高浓度D-葡萄糖和高浓度LPC及各种刺激剂/抑制剂作用下，人肾小球系膜细胞单培养模型中，Fn、Col IV、转化生长因子-β1(TGF-β1)、蛋白激酶cβI cPKcpi)的变化，探讨高糖高脂联合培养条件下PAF所致的ECM分泌增加是否由PKcβI信号通路依赖产生的TGF-β1部分介导。 方法：建立系膜细胞单独培养模型。分为：正常对照组、PAF组、PAF+TGF-β1中和性抗体组、高糖高脂联合培养组、高糖高脂+PAF组、高糖高脂+PAF+TGF-β1中和性抗体组、PAF+LY333531(PKC B抑制剂)组、高糖高脂+PAF+LY333531组。ELISA法测细胞上清液Fn，Col IV的表达变化。实时荧光定量PCR检测系膜细胞TGF-β1、PKCβI mRNA表达。Western-blot检测系膜细胞TGF-β1、PKcβI蛋白表达水平。免疫荧光分析系膜细胞PKcβI表达。 结果：1.与对照组相比，PAF组细胞上清液Fn、Col IV含量均升高(均P<0.05)，而这些作用均可分别被TGF-β1中和性抗体、LY333531所抑制(均P<0.05)。2.与对照组相比，高糖高脂联合培养组细胞上清液Fn、ColIV含量均升高(均P<0.05)，加入PAF后，细胞上清液Fn、Col IV含量升高更明显(均P<0.05)，而这些作用均可分别被TGF-β1中和性抗体、LY333531所抑制(均P<0.05)。3.与对照组相比，PAF均可上调系膜细胞TGF-β1mRNA和蛋白表达(均P<0.05)，而这些作用不能被TGF-β1中和性抗体抑制，但可被LY333531所抑制(均P<0.05)。4.与对照组相比，高糖高脂联合培养系膜细胞TGF-β1mRNA和蛋白表达均增高(均P<0.05)，加入PAF后，系膜细胞TGF-β1mRNA和蛋白表达增高均更明显(均P<0.05)，而这些作用不能被TGF-β1中和性抗体抑制，但可被LY333531所抑制(均P<0.05)。5.与对照组相比，PAF组系膜细胞PKcβI mRNA和蛋白表达均增高(P均<0.05)，PAF可诱导PKCβI表达，以胞核、胞膜明显，可见明显的胞核转位，这些作用均可被LY333531所抑制(均P<0.05)。6.与对照组相比，高糖高脂联合培养可上调系膜细胞PKcpi mRNA和蛋白表达(P均<0.05)，加入PAF刺激后，系膜细胞PKCβI mRNA和蛋白表达更明显(P<0.05)。高糖高脂联合培养可诱导PKCβI表达，以胞核、胞膜明显，可见明显的胞核转位。这些作用均可被LY333531所抑制(均P<0.05)。 结论： 在正常葡萄糖浓度和高糖高脂联合作用下，PAF均可通过激活PKCβI信号通路刺激系膜细胞分泌TGF-β1，而部分促进系膜细胞分泌ECM(Fn、Col IV)。对该信号通路的作用进行干预可能为DN的防治提供新的思路。 第三章阿托伐他汀对高糖高脂条件下系膜细胞的影响 目的：，本研究通过观察在高浓度D-葡萄糖和高浓度LPC及阿托伐他汀作用下，人肾小球系膜细胞单培养模型中，Fn、Col IV、PAF、PAF-R、TGF-β1、PKCβI的变化，探讨阿托伐他汀对高糖高脂联合培养条件下系膜细胞的影响。 方法：建立系膜细胞单培养模型。分为：正常对照组、高糖高脂联合培养组、高糖高脂+阿托伐他汀。ELISA法测细胞上清液Fn，ColIV、PAF的表达变化。实时荧光定量PCR检测系膜细胞PAF-R、TGF-β1、PKCβImRNA表达。Western-blot检测系膜细胞TGF-β1、PKCβI蛋白表达水平。免疫荧光分析系膜细胞PKCβI表达。 结果：1.阿托伐他汀可显著抑制高糖高脂联合培养刺激的细胞上清液Fn、Col IV、PAF含量的升高(均P<0.05)，并可抑制高糖高脂联合培养上调的系膜细胞PAF-R基因表达(P<0.05)。2.阿托伐他汀可抑制高糖高脂联合培养上调的系膜细胞TGF-β1mRNA和蛋白表达(P<0.05)。3.阿托伐他汀可抑制高糖高脂联合培养上调的系膜细胞PKCβI mRNA和蛋白表达(P<0.05)，免疫荧光发现，阿托伐他汀预处理后，高糖高脂联合培养刺激的PKCβI表达及胞核转位显著减少。 结论： 阿托伐他汀的肾保护作用可能与其抑制高糖高脂联合作用刺激的系膜细胞PAF分泌增加、PKCβI/TGF-β1信号通路的激活，而减少高糖高脂联合作用刺激的系膜细胞ECM(Fn和Col IV)分泌增加有关。

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文摘

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引 言

第一章糖、脂对内皮细胞和系膜细胞相互作用的影响

前言

1.1材料

1.2方法

1.3结果

1.4讨论

1.5小结

第二章高糖高脂条件下PAF对系膜细胞的作用机制

前言

2.1材料

2.2方法

2.3结果

2.4讨论

2.5小结

第三章阿托伐他汀对高糖高脂条件下系膜细胞的影响

前言

3.1材料

3.2方法

3.3结果

3.4讨论

3.5小结

结论

参考文献

综述高糖高脂条件下对肾小球细胞影响的研究进展

致谢

攻读学位期间主要的研究成果