ICAM-5通过ERM/PI3K/Akt信号途径减轻Aβ诱导的神经变性

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的典型神经病理特征是患者脑内出现以β-淀粉样蛋白(amyloid beta peptide，Aβ)为主要成分的神经元外老年斑(senile plaque，SP)、神经元内神经原纤维缠结(neurofibilllary tangles，NFTs)、广泛的神经元变性消失。神经元变性凋亡涉及信号转导、基因调控和凋亡效应等三个阶段。信号转导过程的激活是启动细胞变性凋亡的必要前提，从而调控细胞存活与死亡。神经元变性凋亡的发生机制主要涉及两条信号转导通路，即线粒体通路和膜死亡受体通路。二者最后都启动caspase的级联反应而引起神经元凋亡。此外，细胞周期异常也可以影响到神经元的存活。神经元内外存在着在各种致凋亡因素，同时也存在着抗凋亡的相关信号途径，其中经典的抗凋亡信号途径是磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide-3kinase，PI3K)/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Akt)信号通路。 细胞间黏附分子5(Intercellular adhesion molecule-5，ICAM-5，telencephalin)是一种在哺育动物端脑神经元体树突膜特异性表达的复杂黏附分子，具有促进神经元树突生长与影响学习记忆功能的作用。ICAM-5的胞质区结合于埃兹蛋白.根蛋白.膜突蛋白(ezrin-radixin-moesin，ERM)家族蛋白使膜蛋白与细胞骨架肌动蛋白连接起来，而ERM的磷酸化活性形式可以启动PI3K/Akt信号通路。因此，ICAM-5可能通过激活ERM蛋白而启动PI3K/Akt信号通路。但其是否可以对抗Aβ的神经毒性或参与信号传导，目前国内外无这方面的报道。 研究目的：探索ICAM-5是否减轻或缓解Ap的神经毒性作用和激活抗凋亡的PI3K/Akt信号通路来阻断Aβ诱导的凋亡信号传导，为AD和其他神经变性疾病的防治提供相关基础。 研究方法：1.建立神经元模型：用常表达人野生型ICAM-5蛋白的人神经母细胞瘤细胞PAJU-ICAM-5进行连续不加压传代，使其质粒脱失，经免疫荧光和Western Blot鉴定为PAJU细胞后转染含NEO抗性基因的空载体，建立空载体转染的对照细胞模型PAlU-NEO；2.用Aβ作为神经毒性刺激物，分别对PAJU-ICAM-5和PAJU-NEO细胞进行不同浓度和时间段刺激，采用MTT法检测神经元活力、Hoechst33258神经元核染色观察核凋亡、流式细胞仪检测神经元凋亡，以了解ICAM-5是否具有保护神经元对抗Aβ的整体作用；同时用蛋白免疫印迹技术检测Aβ对ICAM-5表达的影响；3.测量在不同浓度和时间段Aβ作用下的神经突起，并使用免疫荧光染色，观察Aβ对神经突起末梢的影响，以了解CAM-5表达是否具有保护神经突起对Aβ的局部作用；4.采用免疫印迹技术检测Aβ刺激作用后磷酸化蛋白的表达，以了解抗凋亡变性信号途径是否被激活。 研究结果：1.PAJU-ICAM-5细胞经不加压连续传代10代后出现质粒完全脱失，经过免疫荧光检测和Western Blot验证无ICAM-5表达；空载体pcDNA3.1转染的PAJU-NEO细胞株建立。2.ICAM-5蛋白常量稳定表达于PAlU细胞后，可减轻Aβ诱导的PAJU细胞凋亡变性，表现为细胞存活率升高和凋亡率降低。同时，表达于PAJU细胞中的ICAM-5蛋白在经受长时间高浓度Aβ42作用后出现降低趋势。3.PAJU-ICAM-5细胞突起分支长度损伤较PAJU-NEO细胞明显减轻。4.通过免疫印记技术发现，ICAM-5蛋白的表达使Moesin蛋白的558位苏氨酸(Thr558)残基磷酸化而形成活化状态，经Aβ刺激后引起其家族蛋白中的Ezfin蛋白的第567位苏氨残基酸(Thr567)和Radixin蛋白的564位苏氨酸(Thr564)出现磷酸化激活，并由此导致了PI3K蛋白调节亚单位p85α的508位酪氨酸残基(Tyr508，p85α)磷酸化，引起PI3K活化，PI3K直接促使Akt蛋白的473位丝氨酸(Ser-473)残基磷酸化而激活了信号通路。5.PI3K特异性抑制剂LY294002不仅下调PI3K蛋白表达，而且还可以下调ICAM-5、磷酸化ERM、磷酸化PI3K及磷酸化Akt蛋白的表达，而总ERM、总PI3K及总Akt却表达于未经LY294002和Aβ处理以及经过LY294002和Aβ处理过的PAJU细胞。提示LY294002可能是这条信号通路上的生物学调节标志。 研究结论：1.我们首次证明了ICAM-5蛋白常表达具有神经保护作用，可以减轻Aβ神经毒性所致的PAJU细胞凋亡及神经突起变性。2.Aβ42与ICAM-5之间具有相互作用，长时间高剂量的Aβ42使ICAM-5表达下调。3.首次发现ICAM-5通过激活ERM而激活PI3K/Akt信号途径，因此减轻Aβ诱导的神经变性。4.LY294002可能是ERM/P13K/Akt信号通路上的生物学调节点。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词简表(Abbreviation)

声明

前言

第一部分 建立稳定表达ICAM-5蛋白和NEO基因的PAJU细胞株

1.材料和方法

2.结果

3.讨论

4.结论

第二部分ICAM-5与Aβ相互作用的初步探讨

1.材料和方法

2.结果

3.讨论

4.结论

第三部分ICAM-5减轻Aβ诱导的神经突起变性

1.材料和方法

2.结果

3.讨论

4.结论

第四部分 ICAM-5激活PI3K/Akt信号通路减弱Aβ诱导的神经变性

1.材料和方法

2.结果

3.讨论

4.结论

全文总结

Reference

Tow-facetted Effects of Amyloid Beta Protein on Neurites

致谢

攻读学位期间发表的论文