P38信号通路在氧化性低密度脂蛋白导致内皮祖细胞数量及功能改变方面的作用

摘要

内皮祖细胞（EPC）是一类能循环、增殖并分化为血管内皮细胞，但尚未表达成熟血管内皮细胞表型特征的前体细胞。研究发现，EPC不仅参与人胚胎血管生成，同时也参与出生后血管新生和内皮损伤后的修复过程。干细胞因子（SCF）、血管内皮细胞生长因子（VEGF），HMG-coA还原酶抑制剂、粒系巨噬系集落刺激因子（GM-CSF）等都能自骨髓动员EPC，并促进其增殖、分化、粘附和迁移能力.氧化性低密度脂蛋白是冠心病独立危险因素，其生物学作用主要是影响内皮细胞功能，并进一步导致动脉粥样硬化。研究证明EPC对维持内皮结构和功能的完整性具有重要作用，并且参与了机体多种生理、病理性血管重建过程，在新形成的血管中，EPC来源的内皮细胞约占总内皮细胞的25％。EPC促进血管生成和内皮再生是因为EPC能够从骨髓动员到外周循环中，并归巢到血管损伤和生成的部位。EPC归巢需要多步骤协调作用，包括趋化、粘附、跨内皮迁移及最终分化为内皮细胞。最近，临床试验表明冠状动脉疾病患者培养的EPC数量及迁移能力明显下降。氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）为心血管疾病的重要独立危险因素，而且冠状动脉疾病及糖尿病患者血浆oxLDL生成明显增加。以前的研究表明oxLDL能够诱导内皮细胞凋亡、增加内皮细胞粘附分子的表达、抑制内皮细胞迁移而抑制血管新生。基于以上研究背景，我们推测。oxLDL可能为影响EPC数量和功能的因素。本研究的目的是观察oxLDL是否影响外周血EPC的数量；是否改变了EPC的增殖功能、迁移功能及粘附能力；oxLDL对EPC的体外血管生成能力的影响程度；同时观察oxLDL是否影响EPC的P38信号表达，来影响EPC的数量、功能。本研究分为二个部分，主要研究方法和结果如下： 第一章氧化型低密度脂蛋白对内皮祖细胞存活和功能的影响 目的：研究氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）对EPC存活及功能的影响方法： 1.EPC的分离、培养：取健康成人空腹外周静脉血，用密度梯度离心法获取单个核细胞，培养7天，收集贴壁细胞。贴壁细胞随机分成5组：①对照组；②oxLDL各浓度组（共3组）：在培养液中分别加入25，50，100，200μg/ml后培养24小时；③LDL组：含100μg/ml的条件培养液培养24h。 2.细胞染色与鉴定：分离获得的单个核细胞培养7d后形成了梭形的内皮样细胞。 4.EPC粘附能力检测：收集贴壁细胞，悬浮在500μl培养液并计数，然后将等量EPC接种到包被有人纤维连接蛋白培养板，在37℃培养30min，计数贴壁细胞。 5.EPC迁移能力检测：收集贴壁细胞并计数。将600μl培养液和VEGF（50ng/mL）加入改良的Boyden室的下室，将2×104EPC悬浮在100μl培养液注入上室，培养24h，刮去滤膜上面的未移动细胞，计数迁移到低层的细胞。 6.EPC增殖能力检测：采用promega公司的Non-Radioactive Cell Proliferation Assay试剂盒MTS/PMS比色法检测细胞增殖率，按操作程序执行。 结果： 1.EPC的鉴定：分离获得的单个核细胞培养3天即可看到贴壁生长，7天后形成梭形的内皮样细胞。用acLDL-Dil和FITC-UEA-Ⅰ对细胞染色后，通过荧光显微镜鉴定UEA-Ⅰ和DiLDL双染色阳性细胞被认为是正在分化的EPC占贴壁细胞的90％。流式细胞仪检测贴壁细胞表面标志。 2.oxLDL对外周血EPC数量的影响：不同浓度的OxLDL干预EPC后24小时，结果显示：oxLDL显著减少EPC数量，并且EPC数量随着oxLDL的浓度的增加而减少。而LDL对EPC数量无影响。 4.OxLDL对外周血EPC迁移功能的影响：OxLDL各浓度组明显减少EPC的迁移能力，而LDL对EPC的迁移无影响。 5.OxLDL对外周血EPC增殖功能的影响：EPC的增殖能力在OxLDL各浓度组抑制了EPC的增殖，并且随着其浓度的增加而加剧。 结论： 1.OxLDL在体外能减少EPC数量，作用呈浓度依赖性； 2.OxLDL在体外能抑制EPC的增殖、迁移、粘附能力，作用呈浓度和依赖性； 3.OxLDL能降低EPC的体外血管生成能力；提示OxLDL是导致EPC数量及功能减弱的因素之一。 第二章P38信号通路参与oxLDL对内皮祖细胞数量和功能的影响 目的：研究oxLDL是否导致EPC细胞内P38及P-P38的表达异常，以及oxLDL对EPC的作用是否与细胞内P38的信号有关。 方法： 1.EPC分离，培养，及分组：EPC的分离及培养见第一章，收集贴壁细胞。贴壁细胞随机三组：①对照组；②oxLDL组：在培养液中加入100μg/ml的oxLDL③SB203580组：在培养液中加入100μg/ml的oxLDL前，预先半小时加入0.5μM的SB203580。 2.Western检测p38及p-p38的表达：oxLDL（100μg/ml）处理EPC后0，5，15，25，35分钟及SB203580预处理后细胞内p38，及p-p38蛋白的表达；以及oxLDL25，50，100，200μg/ml以及LDL100μg/ml处理30分钟后细胞内p38，及p-p38蛋白的表达。 3.EPC凋亡分析： 按BDBiosciences公司的说明进行操作：各组EPC处理结束后，用0.1％胰酶消化，40℃PBS洗两次后，重悬于结合缓冲液中，调整细胞浓度为1×106/ml。取100μl细胞悬液至5ml试管中，加5μlAnnexinⅤ-FITC标记液和5μlPI，轻轻混匀。并设立无AnnexinⅤ及PI的空白对照、仅AnnexinⅤ的对照、仅PI的对照。室温避光孵育15min后，加400μl结合缓冲液，1小时内上流式细胞仪检测EPC双染色鉴定EPC数量，EPC粘附能力检测，迁移能力检测，EPC增殖能力检测，体外血管生成能力检测实验方法见第一章。 结果： 1.western检测结果：100μg/ml的oxLDL处理EPC后，细胞内p-p38成时间依赖性表达增强，大约25min时达顶峰，5，15，25，25，35分钟细胞内p-p38的表达是对照组的1.4±0.15倍，2.1±0.22倍，3.2±0.34倍，1.5±0.13倍，且p38拮抗剂sb203580可抑制其表达，是对照组的1.2±0.13倍，与各时间点比较有显著性差异，P<0.05。不同浓度的OxLDL处理25min后观察，细胞内p-p38成剂量依赖性表达增强，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml处理EPC后，其细胞内p-p38的表达是分别对照组的1.2±0.13，1.7±0.18，3.2±0.35，3.4±0.35。而LDL对其没影响。细胞内p38表达不受时间和浓度的影响。 2.100μg/ml的oxLDL处理EPC后，导致EPC数量减少，增殖减低，凋亡增加，粘附及迁移能力减低，体外成血管能力减弱。而sb203580能减弱100μg/ml的oxLDL对EPC的作用。 结论： oxLDL对EPC的作用与细胞内磷酸化的p38表达及活性有关。P38的抑制剂sb203580能抑制oxLDL对EPC的毒性作用。提示oxLDL对EPC的作用是通过细胞p38信号作用的。

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文摘

英文文摘

论文说明：常用英文缩略词表

声明

第一章氧化性低密度脂蛋白对内皮祖细胞数量和功能的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

第二章P38信号通路参与oxLDL对内皮祖细胞数量和功能的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述·一 p38丝裂原活化蛋白激酶通路及其在动脉粥样硬化中作用的研究进展

综述·二 内皮细胞与冠心病治疗性血管新生的研究进展

致谢

博士研究生期间发表的论文