Gadd45a在CD4T细胞基因病理性低甲基化及系统性红斑狼疮发病中的作用

摘要

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种多器官、多系统受累的自身免疫性疾病。其确切的病因及发病机理至今尚不十分清楚。近年来的研究结果表明T细胞DNA甲基化异常在SLE发病中起十分重要的作用。DNA甲基化是表观遗传学的重要调节机制。基因调节序列甲基化抑制基因转录，而低甲基化则激活基因转录。已有研究表明在体外抑制T细胞DNA甲基化，使T细胞甲基化敏感基因调控序列特定区域低甲基化，从而导致基因过度表达。这些基因包括CD11a(ITGAL)、performl(PRF1)、CD70(TNFSF7)及CD40 ligand(TNFSF5)。过度表达这些基因的T细胞具有自身反应性，杀伤自身巨噬细胞或辅助B细胞产生大量的自身抗体，在动物体内能诱导狼疮样疾病。而且上述甲基化敏感基因在SLE患者CD4+T细胞过度表达，基因调控序列特定区域甲基化水平低下，处于低甲基化状态。因此，SLECD4+T细胞的自身反应性与基因调控序列低甲基化密切相关。目前虽然DNA甲基化转甲基酶机制研究得比较清楚，但是DNA去甲基化的功能和机制仍然属于生物学倍受争议的研究领域。最新的研究结果显示Gadd45a(Growth arrest and DNA-damage-inducible protein45 alpha，即生长停滞与DNA损伤诱导蛋白)可通过促进DNA修复，去除甲基化标记，从而减少表观遗传基因的沉默。紫外线照射可以诱导Gadd45a表达上调，同时紫外线照射可诱发和加重SLE发病，SLE患者T细胞基因组DNA甲基化水平降低。因此，我们提出SLE发病机理之一可能为：核蛋白Gadd45a过度表达→阻抑T细胞基因调控序列甲基化→T细胞甲基化敏感基因过度表达→杀伤自身巨噬细胞或辅助B细胞产生大量自身抗体→SLE。这一假定的发病机制将通过三个部分的研究来证实：1.Gadd45a在SLE CD4+T细胞中的表达及与自身免疫的关系；2.紫外线对Gadd45a乏达和甲基化水平的影响；3.诱导或抑制Gadd45a的表达对正常人CD4+T细胞或SLE CD4+T细胞甲基化敏感基因的表达、调控序列甲基化状态以及自身免疫反应的影响；通过这些研究将进一步揭示导致SLE T细胞基因病理性低甲基化及自身免疫反应的关键环节和分子机制，为SLE治疗寻找有效的新途径提供理论依据。 第一部分SLE患者CD4+T细胞Gadd45a的表达 目的：探讨Gadd45a在SLE CD4+T细胞中的表达及与自身免疫反应的关系。 方法：采用Real-time RT-PCR、Westem blotting的方法分别从mRNA及蛋白水平检测17例SLE患者和10例正常人CD4+T细胞中Gadd45a基因的表达，同时检测细胞基因组DNA总体甲基化水平，并分析二者之间的相关性及其与疾病活动性评分(SLEDAI)的相关性。 结果：和正常人比较，SLE患者CD4+T细胞Gadd45a mRNA和蛋白水平均显著升高(P<0.01或P<0.05)，细胞基因组DNA总体甲基化水平显著降低(P<0.05)，SLE患者CD4+T细胞Gadd45a mRNA水平和SLEDAI评分呈显著正相关(R=0.568，P<0.05)；与细胞基因组DNA总体甲基化水平呈显著负相关(R=0.676，P<0.01)。 结论：SLE患者CD4+T细胞Gadd45a表达显著升高，且与DNA低甲基化及疾病活动性关联。 第二部分紫外线对Gadd45a表达和DNA甲基化水平的影响 第一节紫外线对Jurkat细胞Gadd45a表达和DNA甲基化水平的影响 目的：研究紫外线对Jurkat细胞Gadd45a表达和DNA甲基化水平的影响。 方法：分别以紫外线UVB1.0J/cm2和1.5J/cm2照射Jurkat细胞后，于6小时、12小时、24小时和48小时收集细胞，采用Real-time RT-PCR法检测Gadd45a mRNA水平和甲基化敏感基因CD11a，CD70 mRNA水平，同时检测Jurkat细胞基因组DNA总体甲基化水平的变化。 结果： (1)紫外线UVB1.0J/cm2照射后6小时，Jurkat细胞Gadd45amRNA水平显著升高(P<0.01)，总体甲基化水平显著降低(P<0.05)，CD11a，CD70 mRNA水平也升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。照射后12小时Jurkat细胞Gadd45a CD11a，CD70 mRNA水平均显著升高(P<0.05)，Jurkat细胞总体甲基化水平显著降低(P<0.05)。照射后24小时和48小时，Jurkat细胞Gadd45a mRNA水平升高，CD11a，CD70 mRNA水平升高，基因组DNA总体甲基化水平降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。 (2)紫外线UVB1.5J/cm2照射后6小时、12小时、24小时和48小时，Jurkat细胞Gadd45a，CD11a，CD70 mRNA水平均显著升高(P<0.05或P<0.01)，基因组总体甲基化水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。 结论：紫外线能诱导Jurkat细胞Gadd45a表达上调，同时甲基化敏感基因CD11a，CD70 mRNA表达升高，Jurkat细胞基因组DNA低甲基化。 第二节紫外线对CD4+T细胞Gadd45a表达和DNA甲基化水平的影响 目的：研究紫外线对正常人CD4+T细胞Gadd45a表达和DNA甲基化水平的影响。 方法：免疫磁珠法从3例正常人外周血中分离CD4+T细胞，紫外线UVB1.5J/cm2照射正常人CD4+T细胞后，分别于6小时、24小时、48小时收集细胞，采用Real-time RT-PCR法检测Gadd45a mRNA，甲基化敏感基因CD11a，CD70 mRNA的表达，采用Westem blotting法检测Gadd45a蛋白水平，同时检测CD4+T细胞基因组DNA总体甲基化水平的变化。 结果：紫外线照射后6小时、24小时、48小时的CD4+T细胞Gadd45a，CD11a，CD70 mRNA水平均显著升高(P<0.05)，且Gadd45a蛋白表达显著升高(P<0.05)，基因组DNA总体甲基化水平降低，第48小时总体甲基化水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。 结论：紫外线能诱导CD4+T细胞Gadd45a表达上调，同时甲基化敏感基因CD11a，CD70 mRNA表达升高，细胞基因组DNA总体甲基化水平下调。 第三部分 Gadd45a表达异常与自身免疫关系的研究 第一节 Gadd45a过表达诱导自身免疫反应 目的：诱导Gadd45a过表达对正常人CD4+T细胞甲基化敏感基因的表达、调控序列甲基化状态以及自身免疫反应的影响。 方法：构建Gadd45a表达质粒PCDNA3.1-Gadd45a，电穿孔法瞬时转染正常人CD4+T细胞，采用Real-time RT-PCR法检测甲基化敏感基因CD11a，CD70 mRNA的表达，ELISA法检测细胞增殖活性、自身B细胞IgG抗体产量，试剂盒检测细胞基因组DNA总体甲基化水平及亚硫酸氢钠基因组测序法检测CD11a(ITGAL)序列特异性甲基化状态的改变。 结果：转染PCDNA3.1-Gadd45a的CD4+T细胞Gadd45a，CD11a，CD70 mRNA水平升高，细胞增殖活性及自身B细胞的IgG抗体产量增加，总体甲基化水平降低，差异均有显著统计学意义(P<0.05)。重亚硫酸氢钠测序结果显示ITGAL启动子调控序列平均甲基化水平显著降低(P<0.01)，七个CG位点中有六个位点(-1263，-1255，-1191，-1159，-1121，-1111bp)发生了低甲基化。 结论：Gadd45a过表达可诱导正常CD4+T细胞发生低甲基化，与自身免疫密切相关的甲基化敏感基因表达升高，细胞产生自身免疫性。 第二节下调Gadd45a抑制自身免疫反应 目的：抑制Gadd45a表达对SLE CD4+T细胞甲基化敏感基因的表达、调控序列甲基化状态以及自身免疫反应的影响。 方法：设计针对Gadd45a的小干扰RNA，电穿孔法瞬时转染活动性SLE患者的CD4+T细胞，采用Real-time RT-PCR法检测Gadd45amRNA，甲基化敏感基因CD11a，CD70 mRNA的表达，流式细胞仪检测CD11a，CD70蛋白水平，ELISA法检测细胞增殖活性和IgG抗体产量。同时检测细胞基因组DNA总体甲基化水平及ITGAL特异性序列甲基化状态的改变。 结果：转染后CD4+T细胞Gadd45a，CD11a，CD70 mRNA水平降低，CD11a染色细胞百分率减少，CD70平均荧光强度降低，细胞增殖活性及自身B细胞的IgG抗体产量下降(P<0.05)。细胞基因组DNA总体甲基化水平升高，但差异无显著性。重亚硫酸氢钠测序结果显示CD11a(ITGAL)启动子特异性序列平均甲基化水平显著升高(P<0.05)，七个CG位点中有四个位点(-1263，-1223，-1159，-1121)发生了高甲基化。 结论：抑制Gadd45a的表达可逆转SLE患者CD4+T细胞的异常低甲基化，下调与自身免疫密切相关的甲基化敏感基因表达，抑制自身免疫反应。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前言

第一部分SLE患者CD4+T细胞Gadd45a的表达

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

第二部分紫外线对Gadd45a表达和DNA甲基化水平的影响

第一节紫外线对Jurkat细胞Gadd45a表达和DNA甲基化水平的影响

前言

材料和方法

结果

第二节紫外线对CD4+T细胞Gadd45a表达和DNA甲基化水平的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

第三部分Gadd45a表达异常与自身免疫关系的研究

第一节 Gadd45a过表达诱导自身免疫反应

前言

材料和方法

结果

第二节下调Gadd45a表达抑制自身免疫反应

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

Review ⅠAberrant DNA methylation in skin diseases

Review ⅡEpigenetic Mechanisms of T Lymphocyte Development

致谢

攻读博士学位期间发表的论文