GDNF基因修饰脐血细胞并血脑屏障开放剂对高血压脑梗疗效的实验研究

摘要

目前对于缺血再灌注脑血管疾病的恢复研究热点集中在基因治疗和干细胞治疗上。干细胞移植治疗近年来已成为治疗多种疾病的新策略，其目的是替代、修复或加强受损组织或器官的生物学功能。干细胞具有在体外培养保持未分化状态的增殖能力及分化为各种细胞类型的潜能，正成为生物学、医学中最具有吸引力的研究领域之一。近年的研究发现脐血不仅富含造血干细胞、间质干细胞等多种原始细胞，而且体外实验发现脐血有核细胞具备神经类细胞分化潜能，这预示着将该类细胞应用于神经系统疾病治疗具有应用前景[1，2]。脐血有核细胞来源广泛；细胞原始，分化增殖潜能高；免疫原性低，适合异体甚至异种移植；取材对机体无创伤；细胞移植不存在伦理争议，体外培养过程中能保持未分化表型，经诱导后可分化为神经干细胞。本课题在大脑中动脉缺血再灌注模型动物体内开展应用研究，探讨脐血有核细胞适应脑组织环境的生存能力、分化能力和功效。 研究发现在大鼠大脑中动脉(MCA)梗塞模型中，MCA供血区在缺血再灌后短时间内即有GDNF表达的显著上调，提示GDNF在局灶性脑缺血损伤后参与了神经保护过程。受这些观念及实验研究的启发，结合基因和干细胞治疗优势，将GDNF基因转染到待移植的干细胞，利用干细胞良好的组织相容性和向病灶迁徙的能力，在体内长期稳定表达并发挥作用。如此，既发挥了干细胞的替代及修复作用，又发挥了生长因子的保护促进作用，对脑缺血性损伤的治疗具有重要意义。本实验将脑卒中发生后重要的神经营养因子GDNF基因转染至体外培养的hUCBCs，增加GDNF的浓度，同时营养梗塞区域神经细胞，提高其存活率，提高hUCBCs对缺血再灌注损伤性血管疾病的治疗效果。 目前，GDNF的应用主要采用以下两种方法：一种是直接将纯化的GDNF注入局部脑组织或脑室内。另一种方法是利用基因工程的方法：将GDNF基因直接转染到脑内神经细胞，这两种方法因创伤大，临床推广受到局限。而细胞经体循环特别是静脉移植，在创伤性小方面具有优势，但在细胞向脑损伤区域迁移方面存在不足。 血脑屏障(BBB)的存在，给经血液循环移植细胞的应用带来一定限制，这也是其它干细胞移植在应用方面所面临的难题。要使细胞对中枢神经系统疾病发挥治疗作用，必须首先能通过BBB，这是治疗有效性的先决条件并具有决定意义。 本课题首次采用基因介入、细胞移植联合治疗基础上辅以血脑屏障开放剂治疗脑梗塞，选用脐血细胞，在体外将GDNF基因转移至细胞内，使用能短暂可逆性开放BBB的甘露醇促进细胞移植入脑内，使更多细胞在这段开放时间内进入脑组织达到治疗目的。这种方法既能利用干细胞替代，修复，迁移的能力与特性，又成功的模拟自身细胞分泌神经营养因子的过程，符合生物规律。 目的：探讨GDNF基因修饰人脐血细胞联合血脑屏障开放剂对高血压脑梗塞的疗效。 方法：构建真核表达载体pEGFP-GDNF，并转染至脐血CD344+细胞；制备自发性高血压大鼠大脑中动脉栓塞模型，造模实验动物分为六组，经尾静脉移植：①NS②NS+Manitol③pEGFP+NS④pEGFP+Manitol⑤pEGFP-GDNF+NS⑥pEGFP-GDNF+Manitol。ELISA法检测脑匀浆大脑缺血再灌注局部GDNF含量，用免疫组化、免疫荧光法观察移植细胞的存活、分化情况；TTC染色，计算并比较各组脑梗体积；改良神经损害严重程度评分评价移植对神经功能恢复的影响。 结果：(1)短时间单纯应用血脑屏障开放剂甘露醇对脑缺血再灌无明显影响；与尾静脉移植细胞合用，能促进移植细胞通过血脑屏障入脑(P<0.01)。 (2)移植GDNF基因修饰的hUCBCs能提高体内GDNF水平，并促进移植细胞向神经细胞分化。 (3)与正常对照组比较，pEGFP转染的hUCBCs能减小梗死体积，促进神经功能恢复；pEGFP-GDNF移植组梗死体积减小，神经功能恢复更明显(P<0.01)。 结论：(1)血脑屏障开放剂使移植细胞更容易迁移入脑。 (2)移植GDNF基因转染的hUCBCs能提高局部GDNF浓度。 (3)hUCBCs能增殖分化为神经细胞，GDNF可能促进这种分化。 (4)移植GDNF基因修饰的hUCBCs能减轻脑缺血再灌注损伤，促进神经功能恢复。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词简表

声明

前言

第一部分 真核表达载体pEGFP-GDNT的构建

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、结论

第二部分 GDNF基因转染脐血CD34+干细胞及对其功能影响的研究

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、结论

第三章 自发性高血压大鼠缺血再灌注性脑损伤实验动物模型制备

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

四、结论

第四部分 基因修饰HUCBCs对实验大鼠缺血再灌注修复的研究

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、小结

总结

参考文献

综述 脐血细胞体循环移植治疗脑梗塞的进展

附录 改良神经病学评分标准

致 谢

攻读学位期间主要成果