2'-5'寡核苷酸合成酶基因启动子介导的重组Caspase-3基因治疗丙型肝炎的体外实验研究

摘要

前言：丙型肝炎的防治是目前面临的一项重大问题。至今尚无理想的疫苗和药物防治HCV感染，特别是感染细胞内的HCV难以清除，成为丙型肝炎复发的病毒来源；由于HCV极易发生变异，使其防治更为困难。目前对丙型肝炎的治疗主要采用α干扰素或长效干扰素加利巴韦林，但应答率不高于60％，且停药后可复发，对感染细胞内的HCV作用有限。故研究和开发一种特异有效治疗慢性丙型肝炎的方法具有极其重要的现实意义。 由于慢性HCV感染者肝脏内病毒感染的肝细胞不到肝细胞总数的10％，故特异性诱导只有病毒感染的肝细胞凋亡，而不影响正常的肝细胞是治疗丙型肝炎的新策略。 Caspase家族是细胞凋亡信号通路中关键的分子群，是细胞凋亡过程中的功能执行分子。在Caspase家族中，Caspase-3是重要的下游执行分子，参与细胞染色质的凝聚和核酸酶的激活，促使细胞发生不可逆的凋亡。然而Caspase-3能被上游分子活化但缺乏自身活化的能力，在活细胞中过表达的Caspase-3基因并不能直接诱导细胞凋亡，并经常受凋亡抑制基因的调节。最近，已有通过基因重组的方法来构建在体内能直接诱导细胞凋亡的Caspase-3重组体，它是把处于Caspase-3基因中的大亚基下游的小亚基移位至上游构建而成。重组型Caspase-3在体内外具有自身活化的能力，而且还可以抵抗大多数的Caspase抑制剂和凋亡抑制基因的作用，它在细胞中能够以较低的浓度诱导细胞发生不可逆的细胞凋亡。因此，这种重组活化的Caspase-3分子在以诱导凋亡为目标的基因治疗策略中有着非常好的应用潜能。 如何使导入的Caspase-3基因只在有HCV感染的肝细胞表达和激活，即治疗中的靶向性，是该策略需要解决的关键问题。有研究发现在人肝细胞系中HCV核心蛋白能特异性地与报告基因中的2’-5，寡核苷酸合成酶(OAS)基因启动子结合并激活，即使HCV核心蛋白有少数氨基酸的变异亦不会影响它与OAS启动子的结合和激活效率，而且HCV核心蛋白基因比较保守，如果我们利用OAS启动子来调控Caspase-3基因的表达，可以解决基因治疗的特异性难题。 目的：根据上述研究进展，我们拟利用HCV表达的核心蛋白与OAS启动子特异性结合、启动下游基因表达的特性，使重组活化的Caspase-3基因处于OAS启动子调控下，构建HCV特异性Caspase-3治疗系统，并研究其选择性诱导HCV核心蛋白阳性肝细胞凋亡的作用。 方法：首先，我们从人基因组DNA中克隆OAS启动子并构建荧光素酶报告载体。然后建立稳定表达HCV核心蛋白的肝细胞系L02/core，并分析OAS启动子在L02/core中以及正常肝细胞L02中的活性。 接下来利用基因重组的方法构建OAS启动子调控下的重组型Caspase-3表达载体pGL3-OAS-re-Caspase-3，进一步将其转染入实验细胞中，测定细胞中Caspase-3酶活性。 在己确定该表达载体能够特异性地诱导Caspase-3活性表达的基础上，使用荧光显微镜技术和流式细胞技术来探索OAS启动子调控下的重组Caspase-3系统在肝细胞中诱导凋亡的作用。 结果：限制性酶切及基因测序证实成功构建了OAS启动子调控下的荧光素酶报告载体pGL3-OAS-Luci。RT-PCR及Western-blot证实成功建立了稳定表达HCV-core的肝细胞系L02/core。在L02/core中，OAS启动子的转录活性明显增高，表明HCV核心蛋白可以特异性激活OAS启动子。 限制性酶切及基因测序证实成功构建了OAS启动子调控下的重组型Caspase-3表达载体pGL3-OAS-re-Caspase-3，通过检测Caspase-3特异性底物证实了重组型Caspase-3具有酶活性。进一步使用荧光显微镜技术和流式细胞技术证实了该表达载体具有明显的靶向性诱导HCV核心蛋白阳性肝细胞凋亡的作用。 结论： 1.成功克隆了OAS启动子，并证实HCV核心蛋白能特异性激活OAS启动子。 2.成功构建了重组型Caspase-3基因，并首次构建OAS启动子调控下的真核表达载体pGL3-OAS-re-Caspase-3。 3.首次确定了pGL3-OAS-re-Caspase-3系统能特异性地诱导HCV核心蛋白阳性肝细胞的凋亡。 4.该实验为发展一种有吸引力的、特异性较强的丙型肝炎基因治疗新策略奠定了一定的基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写注解

声明

第一章OAS启动子的克隆及荧光素酶报告载体构建和在表达HCV核心蛋白的肝细胞中的活性分析

1前言

2材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3统计方法

3结果

3.1 OAS启动子的克隆及鉴定

3.2含OAS启动子的重组载体的构建及鉴定

3.3转染细胞中HCV-Core蛋白的表达

3.4荧光素酶活性测定

4讨论

第二章OAS启动子调控的重组型Caspase-3体外诱导HCV核心蛋白阳性肝细胞凋亡的实验研究

1前言

2材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3统计方法

3结果

3.1质粒构建及鉴定

3.2 Caspase-3酶活性分析

3.3荧光显微镜观察

3.4流式细胞术分析

4讨论

总结论

参考文献

综述 丙型肝炎治疗的研究进展

致谢

攻读博士学位期间主要的研究成果