鼻咽癌染色体12p12-11区段扩增基因的筛选及其功能研究

摘要

12p12-11扩增基因的筛选
　　 染色体扩增常导致瘤基因拷贝数增加和过表达,通过检测肿瘤组织中染色体扩增区域内候选瘤基因的过表达已经成为寻找特定肿瘤相关瘤基因的重要途径。染色体12p12-11长度为19Mb,包含123个已知基因和表达序列标签。已有研究表明,+12p是大肠癌的早期事件,可能是生殖细胞肿瘤的晚期事件以及卵巢癌的中晚期事件。利用MEDLINE文献数据库及本实验室已完成的鼻咽癌cDNA微阵列数据资料,我们从12p12-11区初步确定了18个鼻咽癌相关候选瘤基因,其中已明确的瘤基因及候选瘤基因有6个,另外12个基因与细胞转化和增殖相关。采用RT-PCR和定量RT-PCR方法检测鼻咽癌和慢性鼻咽炎组织中这18个基因的表达水平,结果显示:其中9个基因在慢性鼻咽炎与鼻咽癌组织中均无表达;5个基因表达水平在36例鼻咽癌及8例慢性鼻咽炎组织之间无显著差异;而有4个基因,提示其可能与鼻咽癌的发生发展相关。其中KCNJ8为ATP-敏感钾离子通道基因的一个亚类,与细胞的分泌和肌肉收缩有关,而与肿瘤发生及细胞的生长、增殖相关报道较少;PTX1主要参与内质网与高尔基体之间物质的膜运输,仅发现其在前列腺癌中表达下调;KRAS2在鼻咽癌中的研究颇多,其表达明显高于慢性鼻咽炎;而BCAT1基因编码支链氨基转移酶,在Burkitt's淋巴瘤、乳腺癌组织中明显上调,与细胞的增殖和凋亡有关,在鼻咽癌中尚未有相关报道。
　　 BCAT1基因在鼻咽癌不同病理阶段中的表达
　　 从12p12-11筛选出的相关瘤基因回到癌前病变各阶段去考察能认识这些基因在鼻咽癌发病过程中的真正地位和意义,因此我们采用了免疫组化分析BCAT1蛋白在鼻咽正常上皮、增生活跃、轻中度、重度增生和鼻咽癌组织中的表达。结果表明,在正常假复层纤毛柱状上皮、复层鳞状上皮、轻中度增生、重度增生和鼻咽癌组织中均能检测到BCAT1蛋白不同程度的阳性表达,阳性信号定位于细胞胞浆中;BCAT1蛋白在正常上皮、轻中度增生、重度增生和鼻咽癌组织中阳性表达率分别为23.6％、75％、88.9％和88.75;结果提示在鼻咽部出现轻度增生早期病理改变时,BCAT1的表达就明显增高,这说明BCAT1基因对于鼻咽癌的发生可能起重要作用,这也为进一步分析该基因表达异常的分子机制提供了依据。
　　 探讨BCAT1基因在鼻咽癌中异常表达的可能机制
　　 探讨瘤基因表达上调的机制主要从遗传学改变和基因转录调控两方面进行。首先,通过PCR结合测序的方法分析20例鼻咽癌中BCAT1的11个外显子突变情况,共检测出1个外显子区SNP位点,提示基因突变对BCAT的表达无明显影响。其次,拷贝数增加被认为是瘤基因异常激活的一个重要机制,分析基因内部及其附近微卫星位点的扩增可以间接反映基因组中基因的扩增情况。采用Real-timePCR分析了BCAT1基因内部D12S1435、D12S1617和RH44650三个微卫星位点在鼻咽癌组织中扩增情况。
　　 真核基因的转录调控是一个非常复杂的过程,而转录因子参与的基因转录调控起重要作用。生物信息学分析显示在BCAT15'端非翻译区-155/-200bp区域包含有c-Myc结合位点。为了揭示c-Myc是否对BCAT1的表达具有直接调控作用,我们进行了染色质免疫沉淀实验。结果证实,c-Myc转录因子可以直接结合于BCAT1基因启动子区的c-Myc结合位点。RT-PCR与免疫组化表明鼻咽癌中BCAT1和c-Myc的mRNA和蛋白的表达均上调,进一步利用RNA干扰技术建立了稳定干扰c-Myc表达的5-8F鼻咽癌细胞系,结果发现,封闭内源性c-Myc的表达可以下调BCAT1基因mRNA的表达水平。另外,我们将带有包含c-Myc结合位点的BCAT1调控序列与荧光素酶报告基因连接构建重组报告基因载体,分别转染5-8F细胞、转染空白载体的5-8F细胞以及5-8F/si-c-myc细胞中,经报告基因活性分析发现,封闭内源性c-Myc表达后,与对照组相比,重组报告基因的荧光素酶活性降低。而在转染c-Myc基因的COS7细胞系中具有较强的荧光素酶活性。
　　 利用RNA干扰技术研究BCAT1基因在5-8F细胞的作用
　　 采用pSUPER.retro逆病毒载体系统,构建了针对BCAT1的RNAi载体。经测序结果证实后,利用脂质体转染技术将shBCAT1导入5-8F细胞,嘌呤霉素筛选获得抗性克隆,PCR证实抗性克隆中含有shBCAT1;RT-PCR结果表明,shBCAT1表达载体能特异性导致BCAT1mRNA的表达下调了90％;Western:Blotting分析表明细胞中的BCAT1蛋白表达下调了55％左右,这些说明我们已成功地建立了稳定干扰BCAT1基因的5-8F细胞系。
　　 随后,我们进一步考察了BCAT1被干扰后对5-8F细胞生物学特性的影响。流式细胞仪分析结果表明:转染了shBCAT1的5-8F细胞阻滞于G1期,G1期细胞比例增加～16.66％,G2期细胞则减少了～6.91％,而对照组5-8F细胞与转染空白质粒的5-8F细胞之间的细胞周期分布没有明显差异。MTT法检测发现,5-8F-shBCAT1细胞增殖速度明显低于对照组5-8F细胞与5-8F-blankvector细胞,统计学分析差异有显著性。平板克隆形成实验结果显示5-8F-shBCAT1细胞的克隆形成率明显低于转染载体组。另外,迁移实验和侵袭实验证实,5-8F-shBCAT1细胞运动能力和侵袭能力明显降低。
　　 BCAT1与LARS2在鼻咽癌中的相互作用及LARS2在鼻咽癌中下调机制的研究
　　 生物信息学是后基因组时代的利器。STRING是目前已知的、揭示已知和预测蛋白-蛋白之间相互作用的、较广泛使用的数据库。该数据库揭示的蛋白-蛋白相互作用既包括直接相互作用也包括间接关联作用,其中数据来源于基因组背景分析、高通量实验、共表达实验和已公布的数据库。同时,利用STRING还可以比较不同物种间的数据。最新版STRING8.1收录了630个物种、超过2,590,259种蛋白质数据。
　　 在STRING的界面,输入BCAT1,可以找到直接和间接相关蛋白分子10个,它们分别是LRMP、hCG26005、ENSP00000372、BCKDHA、BCKDHB、IARS2、IARS、LARS2、LARS和BCAT1。从这些基因的染色体定位数据中,我们发现LARS2基因位于鼻咽癌患者高频丢失区3p21。
　　 LARS2基因编码亮氨酰-tRNA合成酶。为了探讨LARS2基因在鼻咽癌中的可能作用,我们首先采用了RT-PCR、Real-time PCR方法检测LARS2在8例慢性鼻咽炎组织、36例鼻咽癌组织中的表达。结果发现,LARS2在78％鼻咽癌组织中存在表达下调或缺失,提示LARS2可能是鼻咽癌相关候选抑瘤基因。接着,我们从遗传学和表观遗传学改变两方面探讨了LARS2基因失活的主要机制。1.通过PCR-SSCP并结合测序方法分析了25例鼻咽癌中启动子区和外显子1突变情况,结果未检测出突变和SNP,提示基因突变对于LARS2表达失活无明显影响。2.由于基因内部及其附近微卫星位点的丢失可以间接反映基因组中基因的缺失情况,我们采用了PCR-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染方法分析LARS2基因内部的RH25266和SHGC-12886二个微卫星位点在鼻咽癌组织中的丢失情况。结果表明,至少有28％的鼻咽癌组织中存在LARS2基因微卫星位点的丢失,提示微卫星位点的LOH可能对LARS2在鼻咽癌细胞中表达下调起一定的作用。3.鉴于启动子区DNA异常甲基化是抑瘤基因在表观遗传学改变最为常见的方式,我们首先通过生物信息学软件对LARS2启动子区CpG岛分布情况进行了分析,发现LARS2启动子区存在一个227bp长的CpG岛。以此区域为模板,选择针对该区段的甲基化和非甲基化特异性引物,利用甲基化特异性PCR(methylation-specificPCR,MSPCR)技术,我们分析了慢性鼻咽炎和鼻咽癌组织中LARS2启动子甲基化情况。结果发现,64％鼻咽癌组织和12.5％慢性鼻咽炎组织存在LARS2基因启动子甲基化情况,但鼻咽癌组织中LARS2基因甲基化比率明显高于慢性鼻咽炎组织,两者存在明显的统计学差异,这提示启动子甲基化是导致LARS2基因表达下调的主要因素。
　　 综上所述,通过本研究,我们首次从鼻咽癌发生早期事件+12p12-11区域内发现鼻咽癌相关瘤基因BCAT1,并系统、全面地考察了BCAT1蛋白在慢性鼻咽炎、鼻咽癌及鼻咽癌变不同阶段组织中的表达情况,探讨了导致其表达上调的可能机制,并进一步研究了BCAT1基因在鼻咽癌细胞中的功能。结果提示,BCAT1在慢性鼻咽上皮组织和正常鼻咽上皮中正常表达,而在鼻咽癌组织和鼻咽癌变不同阶段明显表达上调,而这种表达上调主要是由于基因扩增所致,而瘤基因c-Myc对其直接调控也发挥了一定作用。RNA干扰实验表明,干扰BCAT1的表达能够抑制鼻咽癌细胞的增殖,导致细胞周期的阻滞。此外,我们通过生物信息学发现了与BCAT1蛋白有间接相互作用的LARS2蛋白。LARS2基因在鼻咽癌组织中表达明显下调,其失活机制主要是基因启动子区甲基化。鼻咽癌中BCAT1显著上调和LARS2表达下调,共同导致了中间产物L-亮氨酸的累积,而L-亮氨酸则可以通过激活mTOR的信号传导通路最终导致细胞的恶性失控性增殖。当然,生物信息学预测结果还有待实验进一步验证。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:符号说明

前言

技术路线图

第一章 12P12-11扩增的基因筛选

第一节 材料和方法

1 材料与试剂

2 方法

第二节 实验结果

1 RNA抽提

2 平台期测定

3 9个基因在鼻咽癌组织中的表达水平

第三节 分析与讨论

第二章 BCAT1在鼻咽癌中的表达及其异常表达的可能机制

第一节 材料与方法

1 材料

2 方法

第二节 结果

1 荧光定量PCR结果

2 BCAT1蛋白在鼻咽癌变不同病理阶段中的表达检测

3 BCAT1基因突变检测结果

4 BCAT1基因扩增检测结果

5 BCAT1 mRNA表达与基因扩增和突变在同一例标本中的检测

6 BCAT1与c-Myc在鼻咽癌中关系的研究

第三节 分析与讨论

1 Real-time PCR技术验证BCAT1基因在鼻咽癌中表达上调

2 BCAT1蛋白在鼻咽癌不同病理阶段中的表达

3 BCAT1在鼻咽癌中上调机制的研究

第三章 BCAT1基因在鼻咽癌细胞中的功能研究

第一节 材料与方法

1 材料

2 方法

第二节 实验结果

1 短发夹RNA表达载体shBCAT1-1和shBCAT1-2的构建

2 稳定转染5-8F鼻咽癌细胞系

3 mRNA水平鉴定针对BCAT1基因的干扰效果

4 Western Blotting检测干扰后BCAT1基因在蛋白质水平上的变化

5 BCAT1基因被干扰后对鼻咽癌细胞5-8F细胞生物学特性的影响

第三节 分析与讨论

1 RNA干扰技术

2 BCAT1基因表达被干扰后对鼻咽癌细胞系5-8F表型的影响

3 生物信息学分析BCAT1的功能

第四章 LARS2在鼻咽癌中下调机制研究及BCAT1与LARS2在鼻咽癌中的相互作用

第一节 材料与方法

1 材料与试剂

2 方法

第二节 实验结果

1 LARS2在鼻咽癌中的表达

2 LARS2在鼻咽癌中下调机制研究

3 LARS2mRNA表达与基因丢失、突变和甲基化在同一例标本中的检测

4 BCAT1与LARS2 mRNA在同一例鼻咽癌中的表达

第三节 分析与讨论

1 3p21.3在鼻咽癌中的研究

2 抑瘤基因表达失活的机制

3 LARS2在鼻咽癌中的研究

4 BCAT1和LARS2的表达异常在鼻咽癌分子发病机理中的可能作用

结论

参考文献

综述 呼吸道上皮中的短暂扩充细胞——Clara细胞

致谢

攻读学位期间主要研究成果