原发性干燥综合征外周血CD4+T细胞DNA甲基化异常的研究

摘要

目的:原发性干燥综合征(primary sjogren’s syndrome，pSS)是一种以淋巴细胞浸润、产生大量自身抗体、导致泪腺和唾液腺损害为特点的自身免疫性疾病,其发病机制目前尚不明确。近年来,越来越多的研究表明表观遗传学机制,特别是T细胞DNA低甲基化在T细胞基因调控及自身免疫病的发病中起十分重要的作用。如系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)表现出整体的基因组低甲基化和特定基因的低甲基化,如CD11a (ITGAL)、CD70(TNFSF7)、CD40L (TNFSF5)和Perforin (PRF1)。过度表达这些基因的T细胞具有自身反应性,杀伤自身巨噬细胞或辅助B细胞产生大量的自身抗体,在SLE的发生、发展中起十分重要的作用。本课题主要通过研究原发性干燥综合征患者外周血CD4+T细胞中免疫相关的甲基化敏感基因的表达水平及其调节序列的甲基化状态,从而探讨pSS的表观遗传学改变,为揭示pSS的发病机制开辟新途径。
　　方法:密度梯度离心分离17例pSS患者和14例正常人的外周血单个核细胞,用流式细胞检测PBMC中CD11a，CD70及CD40L蛋白在CD4+T细胞中的表达水平;磁珠分选CD4+T细胞,实时定量聚合酶链反应(real-time RT-PCR)检测CD70及Perforin的mRNA表达水平;Western blot检测Perforin的蛋白表达水平;亚硫酸氢钠测序检测表达有差异的基因调节序列的甲基化状态。
　　结果:与正常对照组相比,pSS患者外周血CD4+T细胞CD70的mRNA表达水平显著增加(P=0.001),蛋白表达水平亦显著提高(P=0.003);与正常对照组相比,pSS患者外周血CD4+T细胞Perforin的mRNA表达水平显著升高(P=0.018),而蛋白表达水平无显著性差异。与正常对照组相比,pSS患者外周血CD4+T细胞CD11a和CD40L的表达水平均无显著性差异。pSS患者外周血CD4+T细胞CD70基因启动子的甲基化水平较正常对照组显著降低(P=0.007)。CD70基因启动子DNA甲基化水平与CD70 mRNA表达水平呈显著负相关(r=-0.698,P=0.008)。
　　结论:CD70基因启动子DNA低甲基化可能参与调控原发性干燥综合征患者外周血CD4+T细胞CD70的过表达,提示DNA甲基化异常可能在原发性干燥综合征的发病中发挥重要作用。

目录

中文摘要

英文摘要

第一章 前言

第二章 材料与方法

2.1 研究对象

2.2 仪器设备与试剂

2.2.1 主要仪器设备

2.2.2 主要试剂及耗材

2.2.3 其他常用试剂

2.2.4 常用试剂配制

2.2.5 Western blot所用溶液

2.2.6 克隆所用试剂配置

2.3 实验步骤

2.3.1 外周血单核细胞分离

2.3.2 磁珠分离CD4+T细胞

2.3.3 流式细胞术

2.3.4 RNA抽提

2.3.5 实时定量RT-PCR

2.3.6 蛋白抽提

2.3.7 蛋白定量(BCA法)

2.3.8 Western blot实验步骤

2.3.9 DNA抽提

2.3.10 硫酸氢钠测序

2.3.11 实验总流程图

2.3.12 统计学方法

第三章 结果

3.1 流式细胞术检测外周血CD4+T细胞CD11a、CD70和CD40L的表达水平

3.2 pSS患者外周血CD4+T细胞CD70和Perforin mRNA的表达水平

3.3 western blot检测外周血CD4+T细胞perforin的表达水平

3.4 CD70(TNFSF7)基因启动子调节序列甲基化水平

3.5 CD70基因启动子甲基化水平与CD70 mRNA表达水平的相关性分析

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

综述

致谢

攻读学位期间主要的研究成果