染色体3p21.3区域中口腔鳞癌相关候选抑瘤基因的筛选及其功能的初步研究

摘要

口腔鳞状细胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma，OSCC)是头颈部最常见的恶性肿瘤。尽管传统的手术、放疗、化疗及其综合治疗对早期OSCC可获得较好的治疗效果，但对于晚期或复发的病人难以达到满意的疗效。因此，研究OSCC发病的分子机制，寻找其早期诊断和治疗的分子标志物，将有助于发现新的治疗方法和提高口腔肿瘤病人的生存率和生存质量。
　　 越来越多的研究提示，恶性肿瘤实质上是一种基因疾病，其发生、发展涉及到多种基因的改变。抑瘤基因(tumor suppressor gene，TSG)在人体内往往发挥非常重要的生理功能，其失活、缺失与肿瘤的发生发展密切相关。许多抑瘤基因的发现都是通过研究等位基因杂合性丢失或纯合性丢失(loss of heterozygosity/homozygosity，LOH)而实现的。研究表明，染色体3p21.3区域在肺癌、鼻咽癌等多种肿瘤组织中表现为高频缺失，并存在多个与肿瘤发生密切相关的候选抑瘤基因。多个研究小组发现，该区域在OSCC中同样存在不同程度高频缺失(23％-50％)。目前，该区域内候选抑瘤基因在OSCC发生发展中的作用还鲜少有人研究，大量的信息还有待进一步挖掘。
　　 基于以上原因，本研究拟在文献复习及生物信息学方法分析的基础上，选择该区域内鲜有研究的候选抑瘤基因作为研究对象。筛选在OSCC中表达下调的候选基因并进一步分析其表达失活的可能原因及其在OSCC中的生物学功能。
　　 3p21.3区候选抑瘤基因在口腔鳞状细胞癌中的筛选
　　 首先，通过文献复习，生物信息学的方法分析基因的可能功能，确定11个基因(AUXD1、BAP1、FUS1、GNAT1、LARS2、LTF、NPRL2、RASSF1A、SEMA3F、SEMA3B和ZNF35)为初步研究对象。采用RT-PCR方法分析11个基因在12例OSCC癌组织及其旁侧正常对照组织中的表达情况。结果发现，LYF、GNAT1、SEMA3B、AUXD1基因分别在50％(6/12)，58.3％(7/12)，41.7％(5/12)，41.7％(5/12)的口腔鳞癌组织中表达下调或缺失，与在对应正常口腔组织中的表达存在明显差异(P<0.05)。SEMA3F、RASSF1A基因在口腔鳞癌组织中均表现为25％(3/12)的表达下调或缺失。而ZNF35和LARS2基因在口腔鳞癌组织中表现为33.3％(4/12)和25％(3/12)上调表达。其它3个基因(NPRL2、BAP1、FUS1)在口腔鳞癌组织及其对侧正常对照组织中未见明显表达差异(P>0.05)。初步筛选的结果提示，LTF、GNAT1、EMA3B、AUXD14个基因在OSCC组织中呈现较高频率的下调表达，可能与OSCC发生发展密切相关。为此，我们选择这4个基因作为进一步研究的对象。
　　 启动区异常甲基化在基因表达中的作用
　　 为能较为准确地判断4个基因在OSCC组织中的表达情况，我们采用RT-PCR方法，分析了4个基因在舌癌细胞系TCA8113细胞和36对OSCC组织标本中的mRNA表达水平。结果发现，除AUXD1基因在TCA8113细胞中表达外，LTF、GNAT1、SEMA3B均表达下调或缺失。与癌旁对照口腔组织相比，LTF、GNAT1、SEMA3B、AUXD1基因分别在61.1％(22/36)，44.4％(16/36)，50％(18/36)，47.2％(17/36)的口腔鳞癌组织中表达下调或缺失，统计学分析，4个基因在两组间的表达具有显著差异(P<0.05)。
　　 为考察4个基因的异常表达与临床相关因素的关系。采用χ2检验对数据进行统计分析，结果提示，LTF、AXUD1、GNAT1和SEMA3B的表达均与患者性别无相关性；而仅LTF基因的表达下调与OSCC发生转移有关，有转移的患者，其LTF的表达明显低于没有转移的患者(P<0.05)，其它三个基因均与患者肿瘤转移无明显相关性(P>0.05)。
　　 为进一步探讨基因启动子区甲基化对于基因在OSCC组织或细胞中表达异常的影响，课题采用甲基化特异性PCR(methylationspecific PCR,MSP)分析了LTF、GNAT1、SEMA3B在其表达下调的OSCC组织中各自启动子区甲基化的情况。结果发现，LTF、GNAT1和SEMA3B在OSCC组织中启动子区均有高甲基化，甲基化率分别为72.7％(16/22)、75％(12/16)、77.8％(14/18)，而在癌旁对照组织中三个基因也存在不同程度的的甲基化，其频率也分别为22.7％(5/22)、56.25％(9/16)和38.9％(8/18)。χ2分析表明，LTF和SEMA3B在两种组织中存在启动子区甲基化差异(P=0.000<0.01)，但GNAT1基因启动子区的甲基化在两组间不具有显著差异(P=0.264>0.01)。
　　 甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2-脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-Cdc)处理舌癌细胞株TCA8113，通过RT-PCR和甲基化特异性PCR分别检测了处理前和用不同浓度的药物处理细胞后基因mRNA表达水平和其启动子区甲基化的情况。结果提示：高甲基化能明显抑制舌癌细胞株TCA8113中LTF基因和SEMA3B基因的mRNA表达，而去甲基化后能部分逆转细胞中两个基因的启动子甲基化状态，重新激活或上调该基因的表达。这些结果均提示启动子区高甲基化对于LTF基因和SEMA3B基因表达失活具有重要的作用。
　　 LTF基因在舌癌细胞中的功能研究
　　 相对RT-PCR方法，Real-time PCR能更为准确地检测基因mRNA表达水平，为此，我们在前期分析的基础上，采用Real-time PCR方法进一步验证了LTF基因在OSCC及其癌旁正常对照组织中的表达情况。结果LTF基因表达在OSCC组织中的平均Ct值(9.490±1.675)明显大于癌旁对照组(6.212±4.00)，说明LTF基因在OSCC组织中的表达明显下调(P<0.01)，其下调频率为63.3％(19/30)，并与RT-PCR初筛结果相似。
　　 蛋白质是基因功能的执行者，蛋白质的表达水平与基因功能的发挥密切相关。因此，在检测了LTF mRNA表达水平之后，我们进一步采用免疫组化方法考察了30例OSCC患者石蜡切片中LTF蛋白表达分布的情况。结果显示，LTF蛋白主要表达在细胞胞浆中，并主要分布在鳞状上皮中。30例OSCC石蜡切片中，除4例表现较弱信号外，其余26例癌旁组织上皮均可检测到较强的阳性信号(++)或(+++)，而在癌组织中，除12例检测到阳性信号外，其余18例表现为阴性信号(-)，或较弱信号(+)，其下调频率为60％(18/30)，两组间存在明显差异(P<0.01)。
　　 为了进一步探讨.LTF在舌癌细胞中的作用，我们从购买的pCMV6-XL5-LTF载体中，采用酶切方法分离获得包含LTF开放阅读框序列在内的2.8kb cDNA片段，经测序证实LTFcDNA存在三个插入或错义SNP位点(23R—A29T，K47R)，并经生物信息学分析推测这些位点的多态性可能与LTF的生物学功能无关。将LTF基因的开放阅读框序列克隆到pcDNA3.1(-)载体中，构建了LTF基因的真核表达载体LTF/pcDNA3.1(-)，并重新命名为pcLTF。利用脂质体转染技术将pcLTF导入TCA8113细胞，G418筛选获得抗性克隆，进一步采用RT-PCR检测LTF基因的mRNA表达，采用WesternBlotting检测IXF蛋白的表达，结果表明我们已成功地建立稳定转染pcLXF的TCA8113细胞系TCA-LTF。免疫细胞化学实验显示表达的IXF蛋白主要定位于胞浆。
　　 随后我们检测了LTF基因稳定表达后对TCA8113细胞的生物学特性的影响。利用MTT法和平板克隆形成实验观察LTF基因稳定表达后对LTF细胞增殖能力和克隆形成能力的影响。MTT的结果表明TCA-LTF细胞的增殖速度明显低于对照组(P<0.05)；平板克隆形成实验结果显示TCA-LTF细胞的克隆形成率明显低于对照组(27.7％ vs51.1％/47.7％)。流式细胞分析结果表明，与对照组相比，转染pcLTF后可以使TCA8113细胞停滞于G0-G1期，G0-G1期细胞比例增加(66.37％ vs53.7％)，S期(24.6％ vs32.83％)和G2-M期细胞比例减少(9.05％ vs13.47％)。提示LTF基因稳定表达后，阻止细胞周期进程，导致TCA8113细胞的增殖能力和体外克隆形成能力降低。
　　 总之，本课题以染色体3p21.3缺失区域为切入点，在OSCC组织及其癌旁对照组织中分析了该区域内11个候选抑瘤基因的表达情况。结果提示，在OSCC组织中，LTF、GNAT1、SEMA3B和AUXD14个基因的mRNA表达呈较高水平下调或缺失，并且启动子甲基化可能是影响LTF和SEMA3B表达下调的重要机制之一，但与GNAT1基因表达下调无关。恢复LTF基因的表达，改善了舌癌细胞TCA8113的恶性生物学特性。这些研究结果将有助于了解口腔黏膜癌变的分子机制，也为寻找新的治疗方法和用于早期诊断、治疗的靶标分子提供一定的理论和实验依据。