MICA在NK细胞杀伤胰腺癌中的作用以及吉西他滨对胰腺癌细胞MICA蛋白脱落的影响

摘要

本研究分为三部分：
　　 第一部分、MICA及NK细胞活化性受体NKG2D在胰腺癌表达和临床意义
　　 目的：
　　 探讨MICA及NK细胞活化性受体NKG2D在胰腺癌表达和临床意义。
　　 方法：
　　 RT-PCR技术检测10例胰腺癌、6例慢性胰腺炎和6例正常胰腺组织中MICA mRNA水平。免疫组化技术检测64例胰腺癌、13例慢性胰腺炎和11例正常胰腺组织中MICA的表达。ELISA和流式细胞术分别检测53例胰腺癌，7例慢性胰腺炎和20例健康志愿者血清中可溶性MICA(sMICA)水平和外周血中NK细胞受体NKG2D的表达。
　　 结果：
　　 1.胰腺癌组织MICA mRNA表达水平显著高于慢性胰腺炎和正常胰腺组织(P＜0.01)。
　　 2.免疫组化显示胰腺癌组织中MICA阳性表达率为89.1％，显著高于慢性胰腺炎和正常胰腺组织(P＜0.01)。MICA表达强度与胰腺癌分化程度、远处转移和临床分期密切相关(P＝0.042,0.028,0.003)；MICA高表达的胰腺癌患者预后较好(P＝0.019)。
　　 3.胰腺癌患者血清sMICA水平显著高于健康志愿者和慢性胰腺炎患者(P＜0.01)，Ⅲ/Ⅳ期胰腺癌患者血清sMICA水平高于Ⅰ/Ⅱ期患者(P＜0.01)，有远处转移的胰腺癌患者血清sMICA水平较无转移患者明显增高(P＜0.01)。
　　 4.sMICA阳性胰腺癌患者外周血中NK细胞受体NKG2D的表达强度明显低于健康志愿者、慢性胰腺炎患者和sMICA阴性胰腺癌患者(P＜0.01)。胰腺癌患者外周血中NK细胞受体NKG2D表达强度与血清sMICA水平呈显著负相关(P＜0.01)。
　　 5.胰腺癌根治性切除可以下调患者血清sMICA水平和上调NK细胞受体NKG2D的表达。
　　 结论：
　　 MICA作为免疫监视分子在早期胰腺癌组织中广泛表达，随着胰腺癌进展，MICA从胰腺癌细胞表面脱落形成sMICA，血清中sMICA含量增高可能导致了NK细胞受体NKG2D表达的下调。胰腺癌根治性切除可以下调患者血清sMICA水平和上调NK细胞受体NKG2D的表达。
　　 第二部分、MICA在NK细胞杀伤人胰腺癌PANC-1细胞中的作用
　　 目的：
　　 探讨MICA在NK细胞杀伤人胰腺癌PANC-1细胞中的作用。
　　 方法：
　　 应用NK细胞分选试剂盒从外周血中负向分选高纯度NK细胞用于实验。体外培养人胰腺癌PANC-1细胞和人NK细胞，应用抗体封闭法，观察NKG2D与膜型MICA识别在NK细胞杀伤PANC-1细胞中的作用。将正常NK细胞在含有sMICA阳性胰腺癌患者血清的培基中培养，观察NK细胞受体NKG2D的表达以及NK细胞对PANC-1细胞的杀伤作用。
　　 结果：
　　 1.经MICA或NKG2D抗体封闭后，NK细胞的杀瘤活性较封闭前显著减弱(P＜0.01)。
　　 2.胰腺癌患者血清中的sMICA可以下调NK细胞受体NKG2D的表达，并降低NK细胞对PANC-1细胞的杀伤活性。
　　 结论：
　　 NKG2D与膜型MICA识别在NK细胞杀伤人胰腺癌PANC-1细胞中起重要作用。sMICA是造成胰腺癌免疫逃逸的重要分子机制之一。
　　 第三部分、ADAM10在人胰腺癌PANC-1细胞MICA蛋白脱落过程中的作用以及吉西他滨对MICA蛋白脱落的影响
　　 目的：
　　 探讨ADAM10在PANC-1细胞MICA蛋白脱落过程中的作用，观察吉西他滨对MICA蛋白脱落的影响并探讨可能的作用机制。
　　 方法：
　　 免疫组化检测64例胰腺癌和11例正常胰腺组织ADAM10的表达情况。通过化学合成的小分子干扰RNA(siRNA)下调PANC-1细胞ADAM10表达后，流式细胞术和ELISA分别检测细胞表面MICA的表达强度和细胞上清中sMICA的含量。采用MTT法检测不同浓度吉西他滨对PANC-1细胞增殖的影响。选择浓度为5ng/ml的吉西他滨作用PANC-1细胞24小时，RT-PCR和Western blot检测细胞中ADAM10 mRNA和蛋白表达水平，同时用RT-PCR、流式细胞术和ELISA分别检测MICA mRNA、细胞表面MICA的表达强度和细胞上清中sMICA的含量。先用ADAM10 siRNA或阴性对照siRNA转染PANC-1细胞，转染24小时后，再加入吉西他滨（对照组加等体积培基）继续培养24小时，流式细胞术和ELISA分别检测细胞表面MICA的表达强度和细胞上清中sMICA的含量。
　　 结果：
　　 1.ADAM10在胰腺癌组织中阳性表达率(87.5％)显著高于正常胰腺组织(P＜0.01)。
　　 2.下调ADAM10表达后，PANC-1细胞表面MICA表达增强，而细胞上清液中sMICA的含量减少(P＜0.01)。
　　 3.当培基中浓度小于7ng/ml时，吉西他滨在24小时内对PANC-1细胞增殖无明显影响(P＞0.05)。
　　 4.吉西他滨显著下调PANC-1细胞ADAM10 mRNA和蛋白的表达水平(P＜0.01)。
　　 5.吉西他滨(5ng/ml)作用PANC-1细胞24小时后，细胞表面MICA表达增强，细胞上清液中sMICA的含量减少(P＜0.01)。吉西他滨对PANC-1细胞MICA mRNA表达无明显影响。
　　 6.siRNA下调ADAM10表达后，吉西他滨对PANC-1细胞表面MICA蛋白的表达和上清液中sMICA的含量无明显影响(P＞0.05)。
　　 结论：
　　 ADAM10在PANC-1细胞MICA蛋白脱落过程中具有重要作用。吉西他滨可以抑制PANC-1细胞MICA蛋白的脱落，其机制可能与下调ADAM10的表达有关。