BAG5、PINK1及Parkin的相互作用在帕金森病发病机制中的研究

摘要

背景:
　　 帕金森病(Parkinson's disease,PD)是常见的神经退行性疾病之一,以静止性震颤、肌强直、运动减少和姿势平衡障碍等症状为特征。PD在65岁以上人群患病率高达1.7％,85岁以上人群患病率高达4.8％,严重威胁着中老年人的身体健康。随着PD相关易感基因的发现,遗传因素在PD发病机制中的作用越来越受到关注。自1997年以来已定位了16个遗传性PD的基因位点,并克隆了11个遗传性PD致病基因,其中parkin、.PINK1、DJ-1、ATP12A2、PLA2G6和FBXO7与常染色体隐性遗传早发性帕金森综合征(autosomal recessiveearly-onset parkinsonism,AREP)发病相关。
　　 Parkin基因是1998年克隆的第一个AREP的致病基因。Parkin蛋白是一个含465个氨基酸的蛋白质,分子量约为52kDa,在中脑黑质等脑部各区域广泛表达。Parkin蛋白的功能迄今未完全阐明,相关研究证实Parkin作为E3泛素蛋白连接酶参与蛋白质泛素化过程,并具有线粒体保护作用。
　　 PINK1(PTEN-induced putative kinase1)基因是继parkin基因后第二常见的AREP致病基因。该基因定位于1p36区域,共跨越1.8Kb,包含8个外显子,编码一个由581个氨基酸组成的蛋白质。研究表明PINK1蛋白主要参与调节线粒体的生理功能,可能通过减轻应激状态下线粒体功能障碍和细胞凋亡发挥其保护神经元的作用。目前研究发现PINK1蛋白与其他蛋白之间的相互作用可能对于PD的发病具有极其重要的意义。
　　 BAG(BCL2-associated athanogene,BAG)家族蛋白由于与抗凋亡蛋白bcl-2相互作用而被发现。BAG5(BCL2-associated athanogene5)是该蛋白家族中唯一包含多个BAG结构域的蛋白,BAG5蛋白可通过4个BAG结构域与相关的蛋白质发生相互作用。动物实验研究发现BAG5在小鼠的大脑皮质、海马、红核和黑质致密部均有表达,在黑质致密部的多巴胺能神经元表达水平较高。目前BAG5的功能仍不十分明确,有研究发现BAG5能够促进PD动物模型多巴胺能神经元退行性变,抑制了hsp70分子伴侣的活性;但也有研究发现BAG5蛋白能够促进hsp70的分子伴侣活性。
　　 前期工作中,我们已成功运用酵母双杂交系统进行了PINK1相互作用蛋白的筛选,并成功地筛选到BAG5蛋白,且相互作用编码区位于BAG5蛋白CDS编码区的91-425bp(31-142氨基酸之间)处;此后构建了PINK1与BAG5的真核及原核表达质粒,应用免疫共沉淀技术证实PINK1蛋白与BAG5蛋白在真核细胞内能够相互结合,进一步应用体外结合实验证实PINK1蛋白与BAG5蛋白存在直接相互结合。本研究在前期研究的基础上进一步探讨BAG5、PINK1及Parkin蛋白三者的相互作用机制如何参与了PD的发病过程。
　　 目的:
　　 探讨BAG5、PINK1及Parkin蛋白的相互作用参与PD致病过程的机制。
　　 方法:
　　 1.应用免疫荧光共定位技术,研究野生型PINK1蛋白及BAG5的蛋白亚细胞分布、亚细胞共定位及二者共同转染后亚细胞分布的改变。
　　 2.应用体外蛋白结合实验技术,研究PINK1蛋白与BAG5蛋白的相互结合结构域。
　　 3.应用体外磷酸化与放射自显影技术,研究PINK1蛋白能否直接磷酸化修饰BAG5蛋白。
　　 4.应用chase-time技术,研究BAG5蛋白是否调节了野生型及突变型PINK1蛋白的降解半衰期。
　　 5.应用脂质体过表达、RNA干扰、免疫共沉淀技术,研究BAG5蛋白对野生型及R492X突变型PINK1蛋白泛素化降解的调节。
　　 6.应用脂质体过表达、RNA干扰、免疫共沉淀技术,研究BAG5蛋白及Parkin蛋白对PINK1蛋白泛素化降解水平的共同调节。7.应用脂质体过表达、免疫共沉淀技术,研究野生型、突变型Parkin蛋白对于PINK1蛋白泛素化降解水平的调节。
　　 8.应用免疫组织化学、western-blot技术,研究MPTP诱导的小鼠PD模型黑质多巴胺能神经元中BAG5、PINK1及Parkin蛋白的变化。
　　 结果:
　　 1.应用细胞免疫荧光化学技术证实PINK1及BAG5蛋白存在亚细胞共定位,且二者共转染后BAG5蛋白部分呈现线粒体聚集。
　　 2.应用体外蛋白结合实验证实BAG5蛋白的4个结构域:BAG5(9-86)(第一个BAG结构域)、BAG5(182-260)(第二个BAG结构域)、BAG5(365-442)(第四个BAG结构域)及BAG5(87-181)(第一第二BAG结构域之间区域)均可与野生型PINK1蛋白直接结合。PINK1蛋白的PINK1(156-509)(PINK1蛋白激酶结构域)可与野生型BAG5直接结合。
　　 3.应用GSTPull-down技术与放射自显影技术,通过γ-32P标记的ATP进行体外磷酸化实验证明:PINK1蛋白不能体外磷酸化修饰BAG5蛋白。
　　 4.应用chase-time技术证实BAG5蛋白延长了野生型PINK1蛋白的降解半衰期,起到了稳定野生型PINK1蛋白的作用;同时缩短了R492X突变型PINK1蛋白的降解半衰期,起到了促进R492X突变型PINK1蛋白降解的作用。
　　 5.应用脂质体过表达、RNA干扰、免疫共沉淀技术研究证实BAG5蛋白能够对野生型及突变型PINK蛋白泛素化水平进行调节。BAG5蛋白能够减少野生型PINK1蛋白的多聚泛素化水平,延缓野生型PINK1蛋白的泛素化降解;同时BAG5蛋白能够增加R492X突变型PINK1蛋白的多聚泛素化水平,从而促进R492X突变型PINK1蛋白的泛素化降解。
　　 6.应用脂质体过表达、RNA干扰、免疫共沉淀技术研究证实BAG5与Parkin蛋白通过不同的途径调节PINK1蛋白的泛素化降解,二者相对独立的对PINK1蛋白的泛素化降解过程进行调节。
　　 7.应用脂质体过表达、免疫共沉淀技术研究证实野生型Parkin蛋白减少PINK1蛋白的泛素化降解,突变型Parkin蛋白增加PINK1蛋白的泛素化降解。
　　 8.应用免疫组织化学、western-blot技术研究发现MPTP诱导的小鼠PD模型黑质多巴胺能神经元中BAG5及Parkin蛋白的表达上调而PINK1蛋白表达下调。
　　 结论:
　　 1.PINK1蛋白与BAG5蛋白存在细胞内共定位。
　　 2.PINK1蛋白与BAG5蛋白的结合结构域为PINK1蛋白的激酶结构域;BAG5蛋白与PINK1蛋白的结合结构域为BAG5蛋白的第一、第二、第四个BAG结构域及第一第二BAG结构域之间区域。
　　 3.BAG5蛋白不是PINK1蛋白的直接磷酸化底物。
　　 4.BAG5蛋白抑制了野生型PINK1蛋白的泛素化降解,促进了R492X突变型PINK1蛋白的泛素化降解,BAG5蛋白能够稳定野生型PINK1蛋白,清除R492X突变型PINK1蛋白。
　　 5.BAG5蛋白及Parkin蛋白均可通过泛素蛋白酶体通路独立的调节PINK1蛋白的泛素化降解。
　　 6.Parkin蛋白通过促进PINK1蛋白E3连接酶的降解而抑制了PINK1蛋白的泛素化降解,稳定PINK1蛋白水平。
　　 7.BAG5、PINK1及Parkin蛋白均参与了MPTP诱导的PD的病理过程。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略词

前言

第一节 PINK1蛋白与BAG5蛋白的亚细胞共定位研究

1、材料与仪器

2、实验方法

3、结果

4、分析与讨论

第二节 PINK1蛋白与BAG5蛋白相互结合结构域的研究

1、材料与仪器

2、实验方法

3、结果

4、分析与讨论

第三节 PINK1蛋白对BAG5蛋白磷酸化修饰的研究

1、材料与仪器

2、实验方法

3、结果

4、分析与讨论

第四节 BAG5蛋白对野生型及突变型PINK1蛋白降解的影响

1、材料与仪器

2、实验方法

3、结果

4、分析与讨论

第五节 BAG5蛋白对野生型及突变型PINK1蛋白泛素化降解的调节

1、材料与仪器

2、实验方法

3、结果

4、分析及讨论

第六节 BAG5及Parkin蛋白对野生型PINK1蛋白泛素化降解的共同调节

1、材料与仪器

2、实验方法

3、结果

4、分析与讨论

第七节 野生型及突变型Parkin蛋白对PINK1蛋白泛素化降解的调节

1、材料与仪器

2、实验方法

3、结果

4、分析与讨论

第八节 MPTP诱导小鼠PD模型中黑质多巴胺能神经元BAG5、PINK1及Parkin蛋白的改变

1、材料与仪器

2、实验方法

3、结果

4、分析与讨论

结论

参考文献

附录

综述 BAG家族蛋白对泛素蛋白酶体系统的调控

致谢

攻读学位期间主要的研究成果