Endothelin家族基因SNPs及单体型分子标记及长沙汉族人群脑出血的关系研究

摘要

背景与目的:脑出血(Cerebral hemorrhage,CH)作为脑血管疾病的主要类型之一,其病死率、致残率高,严重危害人类健康。对脑出血病因的研究成为脑血管防治上的重要课题。目前分子遗传学研究认为,脑出血和其他复杂性疾病一样,是由于多个易感的微效基因相互作用,并与环境因素共同作用的结果。因此,对脑出血候选基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)的研究将有助于阐明脑出血的遗传本质,为脑出血易感患者的早期防治提供依据。高血压目前公认是脑出血的独立危险因素,动脉粥样硬化也是脑出血的危险因素之一。长沙是世界脑出血高发区之一,受国家“七五”“八五”、“九五”攻关课题资助,我们既往在长沙地区的多年临床流行病学研究和分子遗传学研究表明,高血压和动脉粥样硬化均是是长沙汉族人群脑出血发病的危险因素,其中高血压和与之有关的遗传因素更是起到至关重要的作用。而内皮素家族(Endothelin Family)及其内皮素家族基因(human endothelin family genes)目前认为与高血压、动脉硬化均有密切关系,可能导致高血压的发生及动脉粥样硬化,增加脑出血的发病风险。迄今,有关内皮素家族基因合成调节途径相关基因与脑出血的关系国内外未见报道。本研究旨在探讨该途径中内皮素-1基因(EDN1)、内皮素受体A基因(EDNRA)、内皮素受体B基因(EDNRB)、内皮素转换酶基因(ECE1)的SNPs和单倍型(haplotype)与长沙地区汉族人群脑出血的关系。
　　 方法:收集2006年1月至2009年12月在湘雅医院神经内科就诊的脑出血患者及部分家属的临床资料和外周血标本,所有病例均经CT和/或MR工确诊。研究对象均来自长沙地区汉族人群,包括:1.有家族聚集现象的脑出血家系组(cerebral hemorrhage with familyhistory,CHFH):共65个家系,包括家系成员281例,男178例,女103例,分为以下亚组:①家系组脑出血患者组:65例,男46例,女19例,平均年龄(52.42±11.50)岁。②Ⅰ级亲属组(CHFH-Ⅰ):133例(包括患者父母,子女及同胞兄弟姐妹),男69例,女64例,平均年龄(39.52±14.17)岁。③Ⅱ级亲属组(CHFH-Ⅱ):36例,男26例,女10例,平均年龄(31.93±12.21)岁。④Ⅲ级亲属组(CHFH-Ⅱ):10例,男7例,女3例,平均年龄(32.65±12.95)岁。⑤健康无血缘关系亲属(unaffected non-blood relatives)共37例,男30例,女7,平均年龄(47.68±7.64)岁。来自以上有家族聚集现象脑出血家系中与先证者无血缘关系的家庭成员,为先证者及其Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级亲属的配偶。2.散发性脑出血(Sporadic cerebralhemorrhage,SCH)组:195例,男133例,女62例,平均年龄(58.40±11.21)岁。3.正常对照(control)组:男75例,女41例,平均年龄(54.97±10.41)岁。
　　 血压的测量:对所有受试对象的血压进行测量。根据2004年《中国高血压防治指南》公布的诊断标准,按收缩压≥140mmHg,和/或舒张压≥90mmHg诊断为高血压。
　　 血脂的检测:采用氧化酶法测定甘油三脂(Triglyceride,TG)、总胆固醇(Total cholesterol,TC);测定高密度脂蛋白(High densitylipoprotein,HDL)先用沉淀剂沉淀,再用氧化酶法测定上清液中的胆固醇;低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)由Friedwald公式:LDL=(CHO-HDL)-TG/5计算。
　　 基因分型:利用多重单碱基延伸SNP分型技术(MultiplexSnapshot)与DNA测序结合相互印证的方法检测所有研究对象内皮素-1合成调节途径4个基因10个SNPs位点多态性,包括:内皮素-1基因的rs1800541、rs2070699、rs5370,内皮素受体A基因rs1801708、rs5333、rs5335,内皮素受体B基因的rs3818416、rs5351,内皮素转化酶-1基因的rs2212528、rs213045。
　　 统计:采用SPSS软件对散发性脑出血与正常对照组进行统计分析,两组间基因型与等位基因频率的差异用x2检验,不同基因型亚组间血压水平比较采用ANOVA方差分析。采用FBAT软件对有家族聚集现象脑出血家系的内皮素家族基因的多态性位点及其构建的单体型进行传递不平衡检验(Transmission disequilibrium test,TDT)。
　　 结果:
　　 1.基因多态性分布特征:长沙地区汉族人群存在EDN-1基因rs1800541、rs2070699、rs5370位点多态性,EDNRA基因rs1801708、rs5333、rs5335位点多态性,EDNRB基因rs3818416、rs5351位点多态性和ECE-1基因rs212528,rs213045多态性。这些多态位点基因型和等位基因分布频率均与世界其他地区人群的基因多态性分布存在不同程度种族差异性。
　　 2.散发性脑出血与正常对照人群的病例-对照研究(case-control study)结果:①散发性脑出血组与对照组EDNRA基因rs1801708、rs5333各基因型及等位基因频率比较有统计学意义(p＜0.05);②散发性脑出血组与对照组EDNRB基因rs5351等位基因频率比较差异有统计学意义,散发组脑出血的最低等位基因G的频率(minor allele frequency,MAF)明显低于对照组(x2=4.83,P＜0.05)。③散发性脑出血组EDN-1基因rs1800541、rs2070699、rs5370多态各基因型及等位基因频率分布与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。④散发性脑出血组与对照组ECE-1基因rs212528,rs213045多态各基因型及等位基因频率分布与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　 3.有家族聚集现象脑出血家系的FBAT研究结果:①TDT分析发现EDNRA基因rs5335多态性位点的等位基因C向后代发生了过度传递现象(P＜0.05)。②EDNRA基因rs1801708、rs5333、rs5335多态位点构成的单体型G-T-C存在过度传递现象(P＜0.05);其中由EDNRA基因rs1801708和rs5335多态位点构成的单体型G-C、由EDNRA基因rs5333和rs5335多态位点构成的单体型T-C也存在过度传递现象(P＜0.05)。③TDT分析未发现EDN-1基因rs1800541、rs2070699、rs5370多态性位点的等位基因存在传递不平衡现象(P＞0.05),这三个位点构建单体型后进行TDT分析也未发现单个特异单体型存在过度传递现象(P＞0.05)。④TDT分析未发现EDNRB基因rs3818416、rs5351多态位点从亲代到患病子代的过度传递现象(P＞0.05),对他们构建的单体型分析也未发现过度传递现象(P＞0.05)。⑤TDT分析未发现ECE-1基因rs212528,rs213045位点多态位点从亲代到患病子代的过度传递现象(P＞0.05),对他们进行单体型构建后TDT分析未发现单个特异单体型存在过度传递现象(P＞0.05)。
　　 4.长沙汉族人群内皮素家族基因多态性对血压水平的影响:①散发性脑出血组EDNRA基因rs5335的GG基因型亚组与GC/CC基因型亚组间舒张压和平均动脉压之间存在显著性差异(P＜0.05)。②散发性脑出血组ECE-1基因rs212528的AA与AG/GG基因型亚组之间的收缩压水平存在显著性差异(P＜0.05)。③散发性脑出血组及对照组EDN-1基因rs1800541的TT基因型亚组与GT/GG基因型亚组之间、rs2070699位点GG基因型亚组与GT/TT基因型亚组之间、rs5370位点的GG基因型亚组与GT/TT基因型亚组之间的收缩压、舒张压和平均动脉压水平均无显著性差异(P＞0.05)。④散发性脑出血组和对照组EDNRB基因rs5351各多态位点的基因型亚组之间的收缩压、舒张压和平均动脉压水平无显著性差异(P＞0.05)。
　　 结论:
　　 1.EDNRA基因rs1801708、rs5333、rs5335,EDNRB基因rs5351位点多态位点可能与长沙汉族人群脑出血发病有关。
　　 2.EDNRA基因rs1801708、rs5333、rs5335多态位点构成的单体型G-T-C、由EDNRA基因rs1801708和rs5335多态位点构成的单体型G-C、由EDNRA基因rs5333和rs5335多态位点构成的单体型T-C可能是长沙汉族人群脑出血的遗传易感因素之一。
　　 3.EDNRA基因rs5335、ECE-1基因rs212528多态位点可能与长沙汉族脑出血易感人群的血压水平有关,其中EDNRA基因rs5335可能通过影响血压而增加了长沙汉族人群脑出血的发病风险。
　　 4.EDN-1基因rs1800541、rs2070699、rs5370,EDNRB基因rs3818416,ECE-1基因rs213045位点多态性可能与长沙汉族人群脑出血和血压水平无关;ECE-1基因rs212528位点与与长沙汉族脑出血易感人群的血压水平有关但与脑出血的易感性无关。

目录

文摘

英文文摘

项目资助

论文说明:缩略词简表

前言

第一章 EDN1基因多态性与长沙汉族人群脑出血的关系

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

附图

第二章 EDNRA基因多态性与长沙汉族人群脑出血的关系

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

附图

第三章 EDNRB基因多态性与长沙汉族人群脑出血的关系

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

附图

第四章 ECE1基因多态性与长沙汉族人群脑出血的关系

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

附图

结论

参考文献

附录

综述一 内皮素家族基因多态性与心脑血管疾病的关系及研究进展

综述二 脑卒中的遗传学研究策略及研究进展

致谢

攻读博士学位期间发表论文及工作成绩