肺炎克雷伯菌氨基糖苷类修饰酶和16S rRNA甲基化酶耐药基因研究

摘要

目的：调查中南大学湘雅医院临床分离的肺炎克雷伯菌药物敏感性,检测氨基糖苷类修饰酶和16S rRNA甲基化酶基因,探讨肺炎克雷伯菌对氨基糖苷类抗菌药物的耐药机制,为临床抗菌药物选用提供实验室依据。
　　 方法：⑴收集中南大学湘雅医院2009年1月至2009年7月间非重复肺炎克雷伯菌96株,所有菌株采用法国梅里埃公司的全自动微生物鉴定系统VITEK-2的革兰阴性菌GN卡鉴定和AST GN-13卡进行药敏分析。采用琼脂稀释法对庆大霉素,阿米卡星,妥布霉素进行MIC检测。⑵采用PCR法对氨基糖苷类修饰酶基因aac(3)-Ⅰ、aac(6’)-Ⅰb、ant(3”)-Ⅰ、aph(3’)-Ⅵ a和16s rRNA甲基化酶基因armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA进行检测。⑶将扩增的DNA产物纯化后进行测序分析,将测序结果通过BLAST与基因库已知序列进行对比分析,确定其基因型。⑷将96株肺炎克雷伯菌耐药基因型与耐药表型进行比较分析,探讨耐药基因与耐药表型的关系。
　　 结果：①96株肺炎克雷伯菌对庆大霉素的耐药率达到63.5％,对妥布霉素的耐药率是41.7％,对阿米卡星耐药率最低,仅为21.9％,对阿米卡星耐药的菌株均对庆大霉素和妥布霉素耐药。三种氨基糖苷类药物的MIC50和MIC90分别≥256μg/ml和＞512μg/ml。②经过氨基糖苷类修饰酶基因PCR扩增及测序分析,96株肺炎克雷伯菌中有18.8％的菌株携带aac(3)-Ⅰ基因(18/96)、57.3％的菌株携带aac(6’)-Ⅰb基因(55/96)、3.1％的菌株携带ant(3”)-Ⅰ基因(3/96)。③aac(6’)-Ⅰb是氨基糖苷类修饰酶基因中最常见的基因型,在环丙沙星敏感菌和耐药菌中aac(6’)-Ⅰb携带率分别为50％(36/72)和79.1％(19/24),经x2检验差异具有统计学意义(x2=6.26,P＜0.05)。④经16s rRNA甲基化酶基因PCR扩增和测序分析,有22株携带armA基因,占22.9％(22/96),其中77.3％(17/22)产armA型甲基化酶基因的菌株对庆大霉素、妥布霉素和阿米卡星同时耐药且都为高度耐药(MICs≥512μg/ml),未检测出aph(3’)-Ⅵ a及rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA型甲基化酶基因。
　　 结论：⑴首次在湖南地区发现aac(3)-Ⅰ、aac(6’)-Ⅰb、antq(3”)-Ⅰ型氨基糖苷类修饰酶基因及armA型16s rRNA甲基化酶耐药基因,氨基糖苷类修饰酶基因以aac(6’)-Ⅰb为主,armA型16s rRNA甲基化酶耐药基因携带率高。⑵肺炎克雷伯菌对氨基糖苷类抗生素的耐药非常严重,阿米卡星耐药率最低,对阿米卡星耐药的肺炎克雷伯菌均对庆大霉素和妥布霉素耐药,阿米卡星可作为氨基糖苷类耐药基因筛查的抗菌药物。⑶产aac(6’)-Ⅰb基因的肺炎克雷伯菌对环丙沙星耐药率明显高于不产aac(6’)-Ⅰb基因的肺炎克雷伯菌对环丙沙星耐药率；产armA型16s rRNA甲基化酶基因的肺炎克雷伯菌大多对氨基糖苷类抗生素呈高度耐药。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

第一章 前言

第二章 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 临床菌株

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器

2.2 方法

2.2.1 技术路线

2.2.2 细菌的培养、鉴定、药敏及保存

2.2.3 琼脂稀释法进行MIC检测

2.2.4 细菌DNA提取

2.2.5 氨基糖苷类修饰酶基因PCR扩增

2.2.6 16s rRNA甲基酶基因PCR扩增

2.2.7 琼脂糖凝胶电泳

2.2.8 PCR产物测序

2.2.9 统计学分析

第三章 结果

3.1 抗菌药物敏感性结果

3.2 氨基糖苷类修饰酶AMEs基因结果

3.3 16s rRNA甲基化酶基因扩增结果

3.4 测序结果

3.5 96株肺炎克雷伯菌的基因型和表型比较结果

第四章 讨论

4.1 抗菌药物敏感性分析与讨论

4.2 氨基糖苷类修饰酶基因结果与讨论

4.3 16S rRNA甲基化酶基因结果与讨论

4.4 96株肺炎克雷伯菌的基因型和表型分析与讨论

第五章 结论

参考文献

综述 氨基糖苷类修饰酶和16SrRNA甲基化酶的研究进展

致谢

攻读学位期间研究成果