糖尿病视网膜病变免疫机制的初步研究

摘要

研究背景：
　　 糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopattly，DR)是糖尿病最常见的并发症之一，而近年来，随着糖尿病患者的逐年增多，糖尿病视网膜病变的患者也逐年升高，成为主要致盲性眼病之一。对糖尿病视网膜病变发病机制的探讨与研究显得非常重要。以往众多此方面的研究公认的观点包括血管病变和代谢因素两方面，近年来炎症免疫因素参与糖尿病视网膜病变的相关研究越来越受到关注。
　　 晚期糖基化终末产物(Advanced Glycation End Products，AGEs)是糖尿病患者体内聚集的特殊产物。它是在体内高血糖的环境下，蛋白质缓慢发生的非酶促糖基化反应，其主要影响体内半衰期较长的蛋白如胶原蛋白、晶状体蛋白，同时受到血糖浓度的影响，并且形成后不易降解。AGEs的形成是一个缓慢的过程，一旦在体内积聚时，即表现出致病的作用。研究表明给予非糖尿病实验动物注射AGEs后，可出现血视网膜屏障的广泛渗漏，最终触发炎症免疫反应，而所形成的血栓导致血管闭塞，使微循环功能发生障碍。
　　 实验动物病理学观察证实，早期糖尿病视网膜病变的表现类似低度慢性免疫炎症对组织的损伤。同时抗炎症或炎症因子的药物如糖皮质激素、非甾体类消炎药等可减轻炎症反应，改善糖尿病视网膜病变的病理改变。AGEs作为糖尿病视网膜病变致病的重要因素，是如何在免疫炎症的发病机制中起作用，至今研究尚未清楚。
　　 视网膜由多种不同类型的细胞所构成。小胶质细胞是一种神经胶质细胞，是中枢神经系统(Central Nervous System，CNS)子抵御病原体入侵的第一防线，被认为是CNS中最具有代表性的免疫细胞[1]。视网膜足CNS是眼部的延续[2]，视网膜小胶质细胞是视网膜固有的免疫活性细胞[3]。视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium，RPE)形成视网膜的外屏障，其在高糖环境下的变化对糖尿病视网膜病变的发病有着非常重要的作用，但是目前对RPE细胞功能和免疫学特性的研究较少。T淋巴细胞并不是视网膜的固有细胞，但是在炎症免疫反应中起核心作用。近年来的研究已经使人们认识到，晚期糖基化终末产物(AGEs)对糖尿病视网膜病变有着非常关键的作用。那么在糖尿病视网膜病变中，AGEs是如何作用于视网膜小胶质细胞以及视网膜色素上皮细胞，从而激活T淋巴细胞，引起一系列的免疫应答，尚不是很清楚。
　　 我们通过实验对糖尿病视网膜病变的免疫机制进行了初步的探讨。我们的研究发现：(1)AGEs可刺激视网膜小胶质细胞，视网膜色素上皮细胞发挥抗原递呈细胞的作用，通过提供活化T淋巴细胞的第一信号和第二信号，使T淋巴细胞活化。(2)但视网膜小胶质细胞比视网膜色素上皮细胞发挥更强的抗原递呈作用，所以视网膜色素上皮细胞只是一种很弱的抗原递呈细胞。(3)所以在AGEs的刺激下，与T淋巴细胞共培养，视网膜小胶质细胞比视网膜色素上皮细胞更能激活T淋巴细胞的活性。(4)T淋巴细胞激活后主要是向TH1，TH2两个方向分化，我们的实验发现，在AGEs的刺激下，T淋巴细胞主要的活化方向是向TH1方向活化，促进细胞免疫反应，导致视网膜自身免疫破坏。
　　 目的：
　　 1探讨AGEs对视网膜小胶质细胞和视网膜色素上皮细胞表达免疫相关因子的作用。
　　 2探讨AGEs对T淋巴细胞活性的影响。
　　 3研究视网膜小胶质细胞和视网膜小胶质细胞在AGEs环境下对T淋巴细胞的影响。
　　 方法：
　　 1利用荧光定量PCR技术，测定在不同浓度的AGEs(0ug/ml，10ug/ml，50ug/ml，100ug/ml，500 ug/ml)培养基中体外培养的视网膜小胶质细胞免疫调控因子MHCⅡ，ICAM-1，CD80和CD86的mRNA水平的变化。同时利用Western-blot方法，检测视网膜小胶质细胞免疫调控因子MHCⅡ，ICAM-1，CD80和CD86的组织蛋白水平的变化。
　　 2利用荧光定量PCR技术，测定在不同浓度的AGEs(0ug/ml，10ug/ml，50ug/ml，100ug/ml，500 ug/ml)培养基中体外培养的视网膜色素上皮细胞免疫调控因子MHC II，ICAM.1，CD80和CD86的mRNA水平的变化。同时利用Western-blot方法，检测视网膜色素上皮细胞免疫调控因子MHCⅡ，ICAM-1，CD80，CD86的组织蛋白水平的变化。
　　 3在不同浓度的AGEs(0，10，50，100，500 ug/ml)培养基中体外培养的T淋巴细胞，流式细胞仪测定活化的T淋巴细胞。利用Western-blot方法，测定在不同浓度的AGEs(0ug/ml，10ug/ml，50ug/ml，100ug/ml，500 ug/ml)培养基中体外培养的T淋巴细胞免疫调控因子IFN-γ，IL-2，IL-10和IL-4的组织蛋白水平的变化
　　 4共培养视网膜小胶质细胞和T淋巴细胞，分别在AGEs(0，10，50，100，500 ug/ml)培养，流式细胞仪测定活化的T淋巴细胞。
　　 5共培养视网膜色素上皮细胞和T淋巴细胞，分别在AGEs(0，10，50，100，500 ug/ml)培养，流式细胞仪测定活化的T淋巴细胞。
　　 结果：
　　 1.视网膜小胶质细胞MHCⅡ，ICAM-1，CD80和CD86的表达经荧光定量PCR检测，正常培养组的视网膜小胶质细胞有以上细胞因子的表达；经AGEs刺激24 h后，视网膜小胶质细胞MHCⅡ，IL-1β，ICAM-1，CD80和CD86的表达明显上调，且这些变化具有剂量依赖性，与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。
　　 2.视网膜色素上皮细胞MHCⅡ，ICAM-1，CD80和CD86的表达经荧光定量PCR检测，正常培养组的视网膜小胶质细胞有以上细胞因子的表达；经AGEs刺激24 h后，视网膜色素上皮细胞MHCⅡ，ICAM-1的表达明显上调，且这些变化具有剂量依赖性，与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)；而视网膜色素上皮细胞CD80和CD86的表达没有明显变化，与空白组比较差异没有统计学意义(P<0.05)，组间比较差异没有统计学意义。
　　 3.在T淋巴细胞和人视网膜小胶质细胞共同培养之后测定，阳性对照组的T淋巴细胞被激活，随着AGEs浓度的增加，表达CD69，CD3的阳性淋巴细胞的细胞百分比渐增。T淋巴细胞IFN-γ，IL-2，IL-4和IL-10的表达经Western-blot检测，正常培养组的T淋巴细胞有以上细胞因子的表达；经AGEs刺激24 h后，T淋巴细胞IFN—γ，IL-2的表达明显上调，且这些变化具有剂量依赖性；而T淋巴细胞IL-4和IL-10的表达没有明显变化。
　　 4.在T淋巴细胞和人视网膜小胶质细胞共同培养之后测定，阳性对照组的T淋巴细胞被激活，随着AGEs浓度的增加，表达CD69和CD3阳性淋巴细胞的细胞百分比渐增。
　　 5.在T淋巴细胞和人视网膜色素上能上皮细胞共同培养之后测定，阳性对照组的T淋巴细胞被激活，随着AGEs浓度的增加，表达CD69和CD3阳性淋巴细胞的细胞百分比渐增。
　　 结论：
　　 1.AGEs可提高视网膜小胶质细胞MHCⅡ，ICAM-1，CD80和CD86的表达，激活视网膜小胶质细胞的免疫活性。
　　 2 AGEs可提高视网膜色素上皮细胞MHCⅡ，ICAM-1的表达，激活视网膜色素上皮细胞的免疫活性，但不能提高视网膜色素上皮CD80和CD86的表达，所以视网膜色素上皮细胞只是弱的抗原递呈细胞。
　　 3 AGEs激活T淋巴细胞细胞的免疫活性，其中可提高T淋巴细胞IFN-γ，IL-2的表达，但不能提高T淋巴细胞IL-4和IL-10的表达，所以在AGEs的刺激下，T淋巴细胞向TH1方向分化。
　　 4视网膜小胶质细胞和T淋巴细胞共培养，在AGEs的刺激下，T淋巴细胞的活性增强。
　　 5视网膜色素上皮细胞和T淋巴细胞共培养，在AGEs的刺激下，T淋巴细胞的活性增强，但T淋巴细胞活化的程度小于T淋巴细胞与视网膜小胶质细胞共培养。