东方田鼠抗日本血吸虫相关基因E77.43部分编码序列的克隆及多克隆抗体的制备

摘要

日本血吸虫病是危害严重的人兽共患寄生虫病.其寄生的哺乳动物繁多,但无论野生的东方田鼠还是室内繁殖的东方田鼠均对日本血吸虫具有天然抗性,且这种抗性可稳定遗传。东方田鼠的这种特性,为抗日本血吸虫病的研究提供新了新的思路。
　　 在前期研究中,本课题组已经建立了东方田鼠骨髓细胞cDNA文库,并利用表达克隆法从东方田鼠骨髓细胞cDNA文库中分离获得了一个具有显著杀伤日本血吸虫童虫活性的基因E77.43的cDNA片段。之后利用RACE等技术得到E77.43全长cDNA序列。对E77.43开放阅读框编码蛋白的序列相似性搜索和多序列比对结果表明,E77.43编码的产物为整合素连接激酶相关丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(integrin-linked kinase-associated serine/threonine phosphatase,ILKAP)。
　　 在此基础上继续工作,本研究首先提取东方田鼠组织细胞RNA并逆转录成cDNA,针对E77.43的开放阅读框序列设计引物,扩增部分编码序列,并将PCR产物克隆到pQE30原核表达载体,对重组载体进行酶切与测序鉴定。然后将重组质粒转化JM109,成功高效的进行原核表达,再用Ni-NTA树脂纯化目的蛋白,透析和冷冻干燥后测定浓度。
　　 我们进一步将纯化后的目的蛋白免疫家兔来制备多克隆抗体。ELISA检测获得了抗体效价为1:6400的多克隆抗体,Western blotting检测结果证实该抗体结合目的蛋白的特异性较好。我们应用自制的抗E77.43多克隆抗体来检测E77.43在东方田鼠不同组织的表达,结果显示E77.43在东方田鼠组织里广泛表达,在肺部表达量较大。
　　 抗E77.43多克隆抗体的制备为进一步研究该基因编码产物在东方田鼠抗日本血吸虫机制中发挥的作用打下了良好的基础。