嗜酸氧化亚铁硫杆菌铁氧还蛋白还原酶的表达纯化及酶活测定

摘要

铁氧还蛋白酶还原酶(ferredoxin NADP+ reductase,FNR)是一种广泛存在于动物、植物、真菌和微生物中的蛋白质,同时可以结合黄素腺嘌呤二核甘酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)和还原型烟酰腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH),其主要功能是催化NADP(H)和铁氧还蛋白(ferredoxin)之间的反应,在电子传递链中具有相当重要的作用。
　　 本论文首先从A.ferrooxidans菌中克隆出铁氧还蛋白还原酶的基因,利用T4连接酶与含T7启动子的载体PLM I连接构建成一个新的质粒。T7启动子是来自T7噬菌体的启动子,具有高度的特异性,只有T7RNA聚合酶才能使其启动,可以使克隆化基因独自得到表达。然后使用大肠杆菌DH5α作为宿主,从而获得大量稳定的,高纯度的重组质粒,最后使用大肠杆菌BL21作为宿主,BL21含有lacUV5启动子,可以编码T7RNA聚合酶,并且它缺失表达ATP依赖型蛋白分解酶(La)的lon基因,这使它失去了外源的异型蛋白质具有特异性的分解作用,所以可以很好的表达克隆体目的蛋白。在优化的表达条件下表达蛋白,并通过一步亲和纯化法分离出带有组氨酸标签的目的蛋白FNR,借助考马斯亮蓝法,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和紫外光谱扫描等试验技术,我们知道了所表达的蛋白浓度为1.441μg/μl,分子量大小为36KDa,在380nm及450nm处有特征吸收峰。最后通过UV测的酶动力曲线,利用米氏方程和双倒数作图法分别测定了FNR在NADPH和EDTA-Fe3+双底物反应中KmNAKPH=0.01787mmol/L,VmaxNADPH=0.0329mmol/L/min,KmEKTA-Fe3+=0.1437mmol/L,VmaxEDTA-Fe3+=0.0011mmol/L/min,本文还用Swiss-model模拟了FNR的分子结构用以帮助从空间结构上直观的了解该蛋白。以上结果对进一步研究FNR在A.ferrooxidans菌中的功能和结构奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 生物冶金(Bioleaching)

1.1.1 研究进展

1.1.2 面临的主要挑战

1.1.3 A.ferrooxidans菌及其铁氧化系统介绍

1.2 铁氧还蛋白还原酶(Ferredoxin-NADP+ reductase,FNR)

1.2.1 铁氧还蛋白还原酶简介

1.2.2 FNR的结构

1.2.3 FNR的系统分类

1.2.4 FNR的催化机理

1.3 课题的研究目的与研究内容

1.3.1 依据和目的

1.3.2 论文的主要研究内容

1.4.3 论文课题受资助情况

第二章 实验方法

2.1 实验的材料

2.1.1 实验所用菌种

2.1.2 实验所用培养基

2.1.3 基因组提取试剂

2.1.4 质粒提取试剂

2.1.5 琼脂糖凝胶电泳

2.1.6 快速胶回收纯化试剂

2.1.7 不连续体系SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.1.8 SDS-PAGE胶保存试剂及装置

2.1.9 亲和纯化试剂

2.1.10 实验仪器与设备

2.2 实验方法

2.2.1 PCR扩增

2.2.2 酶切PCR产物及载体pLM 1

2.2.3 载体和目的片段的连接反应

2.2.4 重组质粒的转化

2.2.5 阳性克隆子的筛选

2.2.6 重组质粒的转化

2.2.7 蛋白质的表达条件

2.2.8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

2.2.9 蛋白质的纯化

2.4 测试分析方法

2.4.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

2.4.2 紫外分光光度计扫描(UV Scanning)

2.4.3 分子结构模型图的模拟(Molecular structure modeling)

第三章 铁氧还蛋白还原酶的表达纯化

3.1 FNR基因的克隆

3.1.1 FNR基因的克隆

3.1.2 阳性克隆的筛选

3.2 FNR的表达

3.2.1 FNR表达条件的确定

3.2.2 FNR大规模的表达

3.2.3 SDS-PAGE分析铁氧还蛋白还原酶

3.2.4 UV/Vis 分析FNR

3.3 本章小结

第四章 分子结构模拟

4.1 序列分析

4.2 结构模拟

4.3 本章小结

第五章 活性测定

5.1 测活方法

5.2 测活结果

5.3 本章小结

第六章 结论

参考文献

致谢

研究成果