慢性吗啡暴露后大鼠物质成瘾行为与海马和伏隔核区PSD-95蛋白及其棕榈酰化水平的关系

摘要

背景:
　　 棕榈酰化是一种受突触兴奋性影响的可逆的重要的蛋白翻译后修饰。PSD-95最近被认为是在物质成瘾机制中调节突触可塑性及成瘾行为的候选基因之一,而棕榈酰化的PSD-95蛋白是调节各种受体在突触后膜上的功能表达及突触可塑性的重要机制。那么,是否PSD-95蛋白及其棕榈酰化参与了成瘾物质吗啡成瘾形成、戒断及复吸,我们首次运用条件性位置偏爱大鼠模型对PSD-95蛋白棕榈酰化的动态变化进行了在体研究。
　　 目的:
　　 (1)建立慢性吗啡诱导条件性位置偏爱(conditioned placepreference,CPP)大鼠模型,了解大鼠吗啡成瘾形成,戒断及复燃期的行为学变化;
　　 (2)了解大鼠海马和伏隔核区PSD-95蛋白在大鼠吗啡成瘾形成,戒断及复燃过程中的动态变化;
　　 (3)探索在慢性吗啡成瘾形成,戒断及复燃期,大鼠条件性位置偏爱与其海马和伏隔核区PSD-95蛋白棕榈酰化水平的关系。
　　 方法:
　　 (1)30只雄性Sprague-Dawlcy(SD)大鼠随机分为吗啡暴露组24只和生理盐水对照组6只。吗啡暴露组给予腹腔注射盐酸吗啡,2次/天,起始剂量为5mgkg-1次-1,逐日递增5 mgkg-1次-1,至第10天为50 mgkg-1次-1,对照组同期注射相同体积的生理盐水。先让大鼠适应CPP箱并评估其非自然偏爱侧,作为伴药侧,然后进行连续十天的吗啡诱导的条件性位置偏爱训练,分别于吗啡暴露前(基线对照)、吗啡暴露终止后2小时(戒断第0天)、戒断第2、8、10天及戒断第12天予小剂量吗啡后测评15分钟内大鼠在伴药侧所停留时间(秒);在戒断期观测大鼠20分钟内戒断体征并计录每只大鼠的体重。数据结果采用单因素方差分析及多重两两比较作统计分析。
　　 (2)根据吗啡暴露十天后的CPP测试结果,吗啡暴露组又分为4个亚组:戒断第0天组(WD0)、戒断第2天组(WD2)、戒断第10天组(WD10)及戒断第12天予小剂量吗啡后复燃组(RE)。各组大鼠分别于戒断第0天、戒断第2天、戒断第10天及戒断第12天复燃后的行为学测定后2小时内,取大鼠海马及伏隔核区,抽提总蛋白,一部分用于Western blot检测PSD-95蛋白的表达,通过与对照组相比,分析各实验组大鼠海马及伏隔核区PSD-95蛋白表达的差异。
　　 (3)大鼠海马及伏隔核区总蛋白的另一部分用基于免疫共沉淀(immunoprecipitation,IP)的棕榈酰基生物素化学标记法(Acyl-biotin exchange labeling assay,ABE)检测PSD-95蛋白的棕榈酰化水平。通过与对照组相比,分析各实验组大鼠海马和伏隔核区PSD-95蛋白的棕榈酰化程度的差异。
　　 结果:
　　 (1)吗啡暴露前,各组大鼠在非自然偏爱侧停留时间无显著性差异;经过十天的吗啡慢性诱导的CPP训练,在吗啡暴露终止后2小时(戒断第0天)及第二天各组大鼠在伴药侧停留时间与对照组相比较显著增加,并逐渐出现明显的戒断症状,体重丧失也开始增加。随着戒断时间的延长,大鼠停留在伴药侧的时间有所下降,但至第十天仍高于基线值,而戒断症状及体重丧失现象也逐渐消失。戒断第十二天给予小剂量吗啡诱导复燃后的大鼠在伴药侧停留时间显著回升,与基线值比较有显著性差异。
　　 (2)大鼠海马及伏隔核区PSD-95蛋白的表达在不同时点的变化趋势相似。与对照组相比,大鼠海马及伏隔核区的PSD-95蛋白的表达在吗啡慢性诱导的CPP训练后有增高趋势,但在戒断期却有降低的趋势并一直维持在一个较低的水平,直至再次给予吗啡复燃,PSD-95蛋白在这两个脑区的表达与对照组相比仍是降低的。
　　 (3)经过十天的吗啡慢性诱导的CPP训练后2小时,PSD-95的棕榈酰化程度在两个脑区有所增高。而从当撤药后自然戒断第二天开始,海马区和伏隔核区的PSD-95蛋白的棕榈酰化程度在不同时点则表现出不同的变化趋势。
　　 戒断第二天,海马区PSD-95蛋白的棕榈酰化显著降低,而伏隔核区的PSD-95蛋白的棕榈酰化程度的显著性增高。而之后的长期戒断期两脑区的PSD-95蛋白的棕榈酰化程度则逐渐恢复到自然状态且一直维持此水平。直至吗啡再次暴露后,两脑区的PSD-95蛋白的棕榈酰化程度仍没有显著性变化。
　　 结论:
　　 (1)慢性吗啡处理的大鼠形成了条件性位置偏爱,终止吗啡处理产生明显的戒断症状,长期戒断后的条件性位置偏爱及戒断症状逐渐消退,当再次接触小剂量吗啡后大鼠又表现出明显的条件性位置偏爱,表明成功建立了大鼠吗啡成瘾,戒断和复燃模型。
　　 (2)在长期成断直至复燃期,大鼠海马及伏隔核区PSD-95蛋白的表达处于低水平,提示PSD-95可能通过调节多巴胺受体和谷氨酸受体在突出后膜上的表达,参与了吗啡诱导的神经可塑性变化;
　　 (3)在大鼠吗啡成瘾形成、戒断期及复燃期的不同时点,海马及伏隔核区PSD-95蛋白的棕榈酰化程度呈不同的变化趋势。这种动态变化提示棕榈酰化可能是PSD-95蛋白参与慢性吗啡诱导的神经可塑性调节的重要机制之一。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词表

第一章 前言

第一节 成瘾的概述

1.1 成瘾的现状

1.2 物质成瘾的解剖学和生化基础

第二节 PSD-95蛋白及其棕榈酰化在神经系统中的作用

2.1 PSD-95蛋白在神经系统中的作用

2.2 棕榈酰化在神经系统中的作用

2.3 棕榈酰化与成瘾

第三节 本研究的基本假设和研究目的

第二章 材料与方法

第一节 慢性吗啡诱导的条件位置偏爱大鼠模型的建立

1.1 实验动物

1.2 实验药品与装置

1.3 实验方法

1.4 统计分析

第二节 检测不同时点的大鼠海马和伏隔核区PSD-95蛋白的表达

2.1 实验试剂和耗材

2.2 实验装置和仪器

2.3 实验方法

2.4 统计分析

第三节 检测不同时点大鼠海马和伏隔核区PSD-95蛋白棕榈酰化程度

3.1 实验试剂和耗材

3.2 实验仪器设备

3.3 所需试剂的准备及配制:

3.4 免疫沉淀

3.5 生物素化学标记法

3.6 统计分析

第三章 结果

第一节 慢性吗啡诱导的条件位置偏爱及戒断、复燃动物模型的建立

1.1 CPP基值与CPP测试值比较

1.2 各组大鼠CPP测试结果比较

1.2 大鼠戒断症状及体重变化比较

第二节 检测不同时点的大鼠海马和伏隔核区PSD-95蛋白的表达

2.1 蛋白质量检测

2.2 各组大鼠海马及伏隔核区PSD-95蛋白的表达水平

第三节 检测不同时点大鼠海马和伏隔核区PSD-95蛋白棕榈酰化程度

3.1 免疫沉淀

3.2 优化NEM反应浓度

3.3 检测各组大鼠蛋白样本中PSD-95蛋白棕榈酰化程度

第四章 讨论

第一节 慢性吗啡诱导的条件位置偏爱及戒断、复燃动物模型的建立

第二节 不同时点的大鼠海马和伏隔核区PSD-95蛋白的表达与条件性位置偏爱的关系

第三节 不同时点大鼠海马和伏隔核区PSD-95蛋白棕榈酰化程度与吗啡诱导的突触可塑性及大鼠成瘾行为的关系

第四节 本研究的创新之处和不足之处

第五节 下一步工作的建议

第五章 结论

参考文献

综述:蛋白的棕榈酰化在神经精神疾病机制研究的进展

致谢

攻读硕士期间发表的学术论文及参研项目