HCVNS3质粒转染的肝细胞中差异表达酪氨酸磷酸化蛋白的筛选

摘要

目的：通过差异磷酸化蛋白质组学研究，筛选和鉴定出HCV/NS3质粒转染肝细胞后差异表达的酪氨酸磷酸化蛋白。
　　 方法：首先建立细胞系，将HCV/NS3质粒(pRcHCNS3-5’)和空白质粒(pRcCMV)分别转染入人源性肝细胞系QSG7701，通过G418筛选，构建稳定表达HCV/NS3蛋白的细胞系(QSG/NS3)和阴性对照组(QSG/CMV)。通过RT-PCR检测转染细胞HCV/NS3表达情况。然后进行蛋白质组学分析，分别抽提两组细胞的总蛋白，每组蛋白平行进行2次双向凝胶电泳，其中一块作为制备胶，另一块作为分析胶，分析胶中将蛋白质转移至PVDF膜后，与抗酪氨酸磷酸化抗体孵育，进行Western Blot分析，获得差异表达酪氨酸磷酸化蛋白质的反应图谱。将制备胶的电泳图谱和Western Blot的反应图谱进行比对分析，在制备胶上找到相应的差异酪氨酸磷酸化蛋白质点，经脱色、还原、酶解，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析，获得肽质量指纹图(PMF)，在http：//www.matrixscience.com/上搜索，匹配蛋白质，应用在线软件Netphos预测蛋白质酪氨酸磷酸化位点。
　　 结果：在QSG/NS3和QSG/CMV两组细胞系中，识别了13个差异表达的酪氨酸磷酸化蛋白质，其中鉴定了8个差异表达蛋白。4个蛋白质的酪氨酸磷酸化水平在QSG/NS3细胞系中表达上调，另4个蛋白质的酪氨酸磷酸化水平表达下调。软件预测每个蛋白质均存在酪氨酸磷酸化位点。
　　 结论：(1)鉴定出8个可能与HCV NS3致病相关的酪氨酸磷酸化蛋白质，为揭示HCV NS3致癌机制提供新的科学理论线索。
　　 (2)鉴定出的差异蛋白功能涉及细胞代谢、凋亡增殖及信号转导等方面。
　　 (3)应用在线软件分析预测蛋白质的酪氨酸磷酸化位点，鉴定出的8个蛋白均有至少一个酪氨酸磷酸化位点。