胆囊癌差异表达基因分析及AXL、Prostasin在胆囊癌侵袭转移中的作用研究

摘要

第一部分胆囊癌差异表达基因分析。
　　 目的：
　　 应用基因芯片技术比较胆囊癌GBC-SD细胞和正常胆囊上皮细胞的差异基因，为探讨胆囊癌侵袭转移机制提供实验依据，并为进一步深入研究胆囊癌的干预治疗奠定基础。
　　 方法：
　　 培养正常胆囊上皮细胞及胆囊癌GBC-SD细胞株，分别提取两组细胞的总RNA，纯化后进行荧光标记，在含有21522个转录本的人基因组寡核苷酸芯片上进行杂交，用LuxScan10KA双通道激光扫描仪进行扫描，根据荧光强度筛选出两者的差异基因，最后用在线分子注释系统(MAS2.0)进行生物信息学分析。
　　 结果：
　　 成功地进行了基因芯片实验，共筛选出2288个在胆囊癌GBC-SD细胞和正常胆囊细胞之间差异表达的基因。814个基因在胆囊癌细胞组中表达上调，1474个基因在胆囊癌细胞组中表达下调，基因功能分类注释系统分类(GO分类)涉及氧化还原、DNA依赖的转录调节、细胞周期、信号转导、蛋白结合、锌离子结合、细胞核成分等；信号通路(Pathway)分析涉及到细胞周期蛋白依赖性激酶调节、固有凝血酶原激活通路、氧化通路、细胞周期调节、血小板淀粉样前体蛋白途径等。
　　 结论：
　　 通过正常胆囊上皮细胞及胆囊癌GBC-SD细胞之间基因表达谱的比较分析，发现了许多新的差异表达的基因，差异基因涉及多种功能蛋白和信号通路，结合文献分析认为AXL及Prostasin可能涉及到胆囊癌的侵袭转移过程，将作为我们下一步的研究对象。
　　 第二部分AXL、Prostasin基因及蛋白在胆囊癌组织中的表达及意义。
　　 目的：
　　 通过检测胆囊腺癌和慢性胆囊炎组织中AXL及Prostasin的mRNA及蛋白质的表达情况，探讨其在胆囊癌侵袭转移中的作用，同时对第一部分基因芯片的结果加以验证。
　　 方法：
　　 分别收集15例胆囊腺癌及15例慢性胆囊炎新鲜组织标本，提取组织的总RNA及总蛋白，用RT-PCR检测AXL及Prostasin mRNA的表达；用Western-blot检测AXL及Prostasin的蛋白质表达，然后进行统计分析。
　　 结果：
　　 1、AXL mRNA在胆囊腺癌中的表达明显上调，与慢性胆囊炎比较有显著差异(1.032±0.031 vs0.293±0.026，P<0.01)；而ProstasinmRNA在胆囊腺癌中的表达明显下调，两者比较有显著差异(0.085±0.023 vs0.721±0.027，P<0.01)。
　　 2、AXL蛋白在胆囊腺癌中的表达明显上调，与慢性胆囊炎比较有显著差异(0.889±0.029 vs0.409±0.017，P<0.01)；而Prostasin蛋白在胆囊腺癌中的表达明显下调，两者比较有显著差异(0.094±0.011vs0.721±0.031，P<0.01)。
　　 结论：
　　 通过与慢性胆囊炎组织相比较胆囊腺癌组织中AXL mRNA及其蛋白均高表达而Prostasin均低表达，这与第一部分基因芯片的结果相一致，AXL、Prostasin基因可能涉及到胆囊癌细胞的上皮间质转化过程的调节，与胆囊癌的侵袭转移相关。
　　 第三部分 RNA干扰抑制AXL基因表达对胆囊癌细胞株GBC-SD生物学特性的影响。
　　 目的：
　　 观察转染干扰载体pRNA-siAXL对胆囊癌细胞系GBC-SD体外侵袭能力、增殖活性等生物学行为的影响，以及对上皮及间质标记物基因CDH1及VIM的表达的影响。
　　 方法：
　　 以转染无关序列pRNA-siNC及未转染的胆囊癌细胞系GBC-SD作为对照，将构建好的3组干扰载体pRNA-siAXL-1、2和3及无关序列载体siRNA-NC转染至胆囊癌细胞系GBC-SD，通过荧光显微镜检测转染结果，筛选出转染效率最高的为pRNA-siAXL-1。利用RT-PCR技术检测转染载体pRNA-siAXL-1前后胆囊癌细胞系GBC-SD中AXL、CDH-1、VIM mRNA的变化，MTT法检测转染前后细胞增殖活性的变化，Transwell小室侵袭实验、划痕试验检测转染前后对细胞体外侵袭能力的影响。
　　 结果：
　　 1、通过荧光倒置显微镜观察，发现转染干扰载体pRNA-siAXL及转染pRNAi-NC中均见绿色荧光表达，pRNA-siAXL-1组转染效率最高，证明转染成功，而未转染组无荧光显示，我们选定pRNA-siAXL-1组作为我们下一步的研究对象。
　　 2、RT-PCR显示转染干扰载体pRNA-siAXL-1组、转染无关序列载体pRNAi-NC组及未转染的胆囊癌细胞共3组中AXL mRNA的相对表达量分别为2.846±0.223、8.261±0.718、9.269±0.845；CDH1 mRNA的相对表达量分别为5.110±0.312、1.023±0.127、1.276±0.326；VIMmRNA的相对表达量分别为0.890±0.134、4.995±0.623、5.274±0.715。经统计分析显示转染干扰载体pRNA-siAXL-1组AXL、VIM mRNA表达量明显低于转染无关序列载体pRNAi-NC组及未转染组(P<0.01)；转染干扰载体pRNA-siAXL-1组CDH1 mRNA表达量明显高于转染无关序列载体pRNAi-NC组及未转染组(P<0.01)；转染无关序列载体pRNAi-NC组与未转染组AXL、CDH1、VIM mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。
　　 3、经MTT法检测从第3天开始转染pRNA-si-AXL-1组细胞增殖速度开始低于转染无关序列载体pRNAi-NC及未转染组，并持续至第6天(P<0.05)，而转染无关序列载体pRNAi-NC和未转染组胆囊癌细胞增殖速度没有统计学差异(P>0.05)。
　　 4、采用Transwell小室侵袭实验检测siAXL对胆囊癌细胞系GBC-SD体外侵袭性的影响。通过细胞计数统计分析发现，干扰载体pRNA-siAXL-1组、转染无关序列载体pRNAi-NC组及未转染组穿膜细胞个数分别是43.6±3.27、71.2±6.45、82.8±7.34，转染干扰载体pRNA-siAXL组的细胞穿膜数明显低于转染无关序列载体pRNAi-NC组及未转染组(P<0.05)。
　　 5、于划痕后0、48小时在100倍倒置相差显微镜下观察并拍照，结果显示划痕后0小时含有三组细胞的划痕区面积基本相等。48小时后，含有pRNA-siAXL-1载体的细胞少量迁移，而含有pRNAi-NC载体及未转染载体的胆囊癌GBC-SD细胞明显向划痕区迁移。
　　 结论：
　　 胆囊癌细胞系GBC-SD转染pRNA-siAXL后，细胞中AXL基因表达明显受到抑制，同时CDH1基因表达上调，VIM基因表达下调，可能与AXL能促进胆囊癌细胞的上皮间质转化过程有关。AXL的下调使胆囊癌细胞的体外侵袭能力减弱，增殖活性降低。
　　 第四部分胆囊良恶性病变组织中AXL和Prostasin的表达及其临床病理意义。
　　 目的：
　　 研究胆囊良恶性病变组织中AXL和Prostasin表达水平并探讨其临床病理意义及在胆囊腺癌侵袭转移中的作用。
　　 方法：
　　 100例胆囊腺癌、46例癌旁组织、15例腺瘤性息肉和35例慢性胆囊炎组织标本常规制作石蜡包埋切片，AXL和Prostasin染色方法为EnVisionTM免疫组化二步法。
　　 结果：
　　 (1)100例胆囊腺癌中AXL阳性表达为62例(62％)，46例癌旁组织为11例阳性(23.9％)，15例腺瘤性息肉为2例阳性(13.3％)，35例慢性胆囊炎胆囊上皮为3例阳性(8.6％)，胆囊腺癌AXL表达阳性率明显高于癌旁组织、腺瘤性息肉和慢性胆囊炎胆囊上皮(P<0.01)；100例胆囊腺癌中Prostasin阳性表达为52例(52％)，46例癌旁组织为39例阳性(84.8％)，15例腺瘤性息肉为13例阳性(86.7％)，35例慢性胆囊炎胆囊上皮为34例阳性(97.1％)，胆囊腺癌Prostasin表达阳性率明显低于癌旁组织、腺瘤性息肉和慢性胆囊炎胆囊上皮，差异均有显著或高度显著性(P<0.05或P<0.01)；AXL阳性表达和(或)Prostasin阴性表达的良性病变的胆囊上皮均呈不同程度的不典型增生。
　　 (2)高分化腺癌、肿块最大径<2cm、无淋巴结转移、未侵犯周围组织的病例中AXL表达阳性率明显低于低分化腺癌、肿块最大径≥2cm、淋巴结转移及侵犯周围组织的病例(P<0.05或P<0.01)；但Prostasin表达阳性率则相反(P<0.05或P<0.01)；
　　 (3)经Kaplan-Meier单因素生存分析发现，病理类型、肿块最大径、淋巴结转移状况、侵犯周围组织状况及AXL和Prostasin表达状况均与胆囊癌患者术后平均生存期均有密切关系(P<0.05或P<0.01)；AXL表达阳性病例术后生存期明显低于阴性表达病例(P<0.05)，而Prostasin表达阳性的病例则相反(P<0.05)。AXL(+)Prostasin(-)比AXL(-)Prostasin(+)患者生存时间有显著缩短(P<0.01)；Cox回归多因素分析显示AXL表达阳性(P=0.003)或Prostasin表达阴性(P=0.032)均是胆囊腺癌预后不良的独立的评估指标。