沙眼衣原体CT703蛋白在感染细胞中的表达及功能初探

摘要

一、研究目的：
　　 1.研究CT703蛋白在沙眼衣原体感染细胞中的表达模式、持续性感染状态下CT703蛋白的表达变化。
　　 2.研究CT703蛋白对Raf/MEK/ERK信号通路的激活及抗凋亡作用。
　　 二、研究方法：
　　 1.RT-PCR法扩增沙眼衣原体L2血清型CT703基因全长序列并亚克隆到原核表达质粒pGEX-6p-1中。
　　 2.IPTG诱导重组质粒pGEX-6p-1/CT703在大肠杆菌BL21中表达相应的重组融合蛋白，利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并纯化重组融合蛋白，以纯化的重组融合蛋白作为免疫原免疫小鼠制备抗CT703蛋白多克隆抗体。
　　 3.采用Western Blot和免疫荧光技术，以抗CT703蛋白多克隆抗体为一抗检测CT703蛋白在沙眼衣原体急性感染状态下的表达模式。
　　 4.采用RT-PCR和Western Blot技术分别检测在干扰素-γ诱导沙眼衣原体持续性感染状态下CT703mRNA和蛋白水平表达变化。
　　 5.构建CT703基因真核表达重组质粒pcDNA4/CT703并转染HeLa细胞，Western Blot技术检测CT703蛋白是否活化Raf/MEK/ERK信号通路；并检测转染细胞在十字孢碱(Staurosporine，STS)作用下，细胞凋亡率以及Caspase-3活性变化。
　　 三、研究结果：
　　 1.利用RT-PCR技术扩增沙眼衣原体L2血清型CT703基因，扩增片段长度约1.5kb，与预期理论值大小一致。重组质粒pGEX-6p-1/CT703经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后，约在1.5kb处同样出现特异性DNA条带。通过DNA测序，证实插入的基因序列与GenBank公布的CT703基因序列完全一致，表明重组质粒构建成功。
　　 2.原核表达重组质粒pGEX-6p-1/CT703经IPTG在大肠杆菌BL21中诱导表达，纯化产物经考马斯亮蓝染色显示产物分子量约81kDa，由55KDa的CT703蛋白和26KDa的GST蛋白组成，与预期理论的分子量大小一致。以抗GST蛋白抗体为一抗，Western Blot技术检测纯化的重组融合蛋白，在81KDa处检测到相应的蛋白条带。WersternBlot实验证实以重组融合蛋白免疫小鼠制备的抗血清能与CT703蛋白特异性结合；间接ELISA法检测抗血清效价，结果显示抗体滴度最高达到1:32000。
　　 3.利用Western Blot技术检测CT703蛋白在沙眼衣原体急性感染状态下的表达，感染后24小时可检测到相应的蛋白，随着感染时间的延长，蛋白表达量逐渐增多，并持续存在于整个感染过程，未感染细胞组没有检测到CT703蛋白的表达；通过免疫荧光技术检测CT703蛋白表达，最早在感染12小时即可检测到相应的蛋白。在干扰素-γ诱导沙眼衣原体持续性感染状态下，RT-PCR和Western Blot技术检测CT703 mRNA和蛋白的表达情况，结果表明持续性感染状态下CT703 mRNA和蛋白表达不呈时间依赖性，相同时间点沙眼衣原体持续性感染状态下CT703 mRNA和蛋白水平明显低于急性感染状态。
　　 4.间接免疫荧光技术对内源性的CT703蛋白进行定位，结果显示沙眼衣原体感染细胞CT703蛋白的荧光染色部位既不同于胞浆蛋白CPAF，也不同于包涵体膜蛋白CT813。
　　 5.构建的真核表达重组质粒pcDNA4/CT703经PCR、双酶切实验证实插入片段大小与CT703基因片段大小一致，测序证实插入的基因序列与GenBank公布的CT703基因序列完全一致。重组质粒pcDNA4/CT703转染到HeLa细胞后，Western Blot和免疫荧光实验均能检测到CT703蛋白的表达。
　　 6.真核表达重组质粒pcDNA4/CT703转染HeLa细胞后36小时检测磷酸化的Raf、ERK，发现二者均未被磷酸化；转染质粒36小时后，STS诱导细胞凋亡5小时，用流式细胞术检测细胞凋亡率以及用Caspase-3活性检测试剂盒检测Caspase-3活性。同时设STS诱导的HeLa细胞组、STS诱导的沙眼衣原体感染组和正常HeLa细胞组作为对照，发现4组细胞的凋亡率分别为：(93.1±2.01)％、(91.3±1.67)％、(3.21±0.87)％、(2.08±0.76)％。统计学分析，STS诱导的重组质粒转染组与正常HeLa细胞组比较有显著性差异，与STS诱导的衣原体感染组比较有显著性差异(P<0.05)，与STS诱导的HeLa细胞组比较没有显著性差异(P>0.05)。Caspase-3活性检测结果与细胞凋亡率一致。
　　 四、结论：
　　 1.成功构建原核表达重组质粒pGEX-6p-1/CT703以及真核表达重组质粒pcDNA4/CT703。
　　 2.沙眼衣原体急性感染状态下CT703蛋白表达呈时间依赖性增加，持续性感染状态下CT703蛋白表达不呈时间依赖性；相同时间点沙眼衣原体持续性感染状态下CT703蛋白表达明显低于急性感染状态。
　　 3.CT703蛋白不能激活Raf/MEK/ERK信号通路，不能抑制STS诱导的细胞凋亡。