鼻咽癌双特异性抗独特型抗体疫苗的生物学活性鉴定及免疫机制研究

摘要

第一章、鼻咽癌人源双特异性抗独特型抗体疫苗的制备及活性鉴定
　　 目的：构建能够表达全人源鼻咽癌双特异性抗独特型抗体的原核表达载体pET25b-G22-I50及单价抗独特型抗体的原核表达载体pET25b-G22、pET25b-I50，并对其表达产物作初步鉴定。
　　 方法：利用分子克隆技术依次或分别将G22、I50插入到原核表达载体pET25b(+)中，转化入E.coli DH5α，经菌落PCR、双酶切验证并测序。将阳性重组子转化入表达菌株E.coli BL21(DE3)，经IPTG诱导表达后，表达的重组蛋白经His-tag纯化试剂盒纯化后复性。用Western blot方法鉴定抗独特型抗体G22-I50、G22、I50的表达，ELISA方法分析其蛋白活性。
　　 结果：构建的原核表达载体pET25b-G22-I50、pET25b-G22、pET25b-I50经测序验证，序列正确。三种蛋白G22-I50、G22、I50均以包涵体形式高效表达，经纯化后纯度达90％以上。Western blot鉴定表达的蛋白相对分子质量(Mr)分别约42000，27000，15000，与预期相符。ELISA方法鉴定复性后的蛋白均已恢复活性，能够用于体外实验。
　　 结论：成功获得了有活性的人源双特异性抗独特型抗体G22-I50及单价的抗独特型抗体G22、I50，为研究鼻咽癌抗独特型抗体疫苗的主动免疫机制鉴定了坚实的基础。
　　 第二章、双特异性抗独特型抗体体外抗肿瘤免疫机制研究
　　 目的：比较鼻咽癌双价双特异性抗独特型抗体G22-I50与单价的抗独特型抗体G22、I50在体外抗肿瘤免疫情况，并对其可能的机制作初。
　　 方法：诱导表达G22-I50、G22、I50三种蛋白并用Western blot及ELISA方法进行活性鉴定。常规分离人外周血单个核细胞(PBMC)，分别用G22-I50、G22、I50抗独特型抗体刺激并培养，采用MTT法、LDH释放法分别观察淋巴细胞增殖情况和细胞毒作用，ELISA方法测定用各抗独特型抗体刺激后培养上清液中IFN-γ、IL-2、IL-4水平的变化，流式细胞术检测刺激后淋巴细胞表型的改变。
　　 结果：与G22、I50组相比，G22-I50刺激后的PBMC增殖明显，且对鼻咽癌细胞HNE2有特异的杀伤作用。G22-I50刺激后的PBMC培养上清液中IFN-γ、IL-2水平均比G22、I50组有所增加，而对IL-4水平没有明显影响。流式细胞术显示刺激后的PBMC中CD4+、CD8+T细胞比例增加，CD4/CD8的比率增加，而CD4+CD25+Treg细胞的比例有所减少，其中以G22-I50组最为明显。
　　 结论：G22-I50具有更强的免疫原性并能增强PBMC的特异性杀瘤作用，其机制可能与促进PBMC的增殖，诱导具有抗肿瘤作用的Th1细胞因子的分泌并活化CD8+T细胞，抑制CD4+CD25+Treg细胞的表达有关。
　　 第三章、双特异性抗独特型抗体体内抗肿瘤免疫机制研究
　　 目的：分别利用Balb/c小鼠和hu-PBL-SCID小鼠模型研究双特异性抗体疫苗的抗肿瘤效应，并对其可能的机制作深入探讨。
　　 方法：将双特异性抗独特型抗体疫苗G22-I50及单价的抗独特型抗体疫苗G22、I50分别免疫 Balb/c小鼠，通过间接ELISA、竞争抑制ELISA法检测各蛋白疫苗免疫后诱导的体液免疫反应情况；通过淋巴细胞增殖实验检测免疫后小鼠的细胞免疫反应情况；通过检测Th1，Th2型细胞因子的表达情况，以判断各蛋白疫苗免疫后的免疫反应类型。以腹腔注射PBMC法重建SCID小鼠的免疫系统并进行鉴定，分别将上述几种抗独特型抗体疫苗免疫hu-PBL-SCID小鼠，并接种鼻咽癌细胞HNE2，或先接种HNE2细胞后再用各种疫苗免疫hu-PBL-SCID小鼠，评价疫苗的抗肿瘤免疫保护与免疫治疗作用。定期检测肿瘤体积、记录肿瘤形成的潜伏期，生存时间，并对肿瘤组织作病理学检查。同时，用双抗夹心ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中细胞因子的分泌情况，用LDH法检测脾淋巴细胞的杀伤活性，以FCM法、免疫组织化学法检测肿瘤组织周围浸润的淋巴细胞情况。
　　 结果：分别用G22-I50、G22、I50免疫Balb/c小鼠后，通过间接ELISA和竞争抑制ELISA法检测发现，G22-I50免疫后小鼠能够产生较高水平的Ab3抗体，且具有较强的竞争结合HNE2细胞相关抗原的能力；G22-I50免疫后小鼠的脾淋巴细胞具有较强的增殖能力，并能表达高水平的IFN-γ、IL-2。成功的重建了SCID小鼠的免疫系统，并通过免疫保护实验、免疫治疗实验对其抗肿瘤效应进行了评估，发现G22-I50能够延长肿瘤形成的潜伏期，生存时间，能够抵抗肿瘤的生长，并通过病理学检查得以证实。通过EL，ISA法检测发现G22-I50组的脾淋巴细胞分泌的细胞因子最多，且以Th1型细胞因子为主，脾淋巴细胞的特异性杀伤能力也有明显增强，以FCM法、免疫组织化学法检测发现G22-I50组肿瘤周围浸润的CD4+CD25+Treg细胞显著减少，CD3+T细胞显著增加。
　　 结论：G22-I50能够同时激活机体的体液免疫反应和细胞免疫反应，并能诱导Th1细胞因子的分泌，促进CD3+T细胞的浸润，抑制CD4+CD25+rreg细胞的浸润，从而发挥其抗肿瘤效应。
　　 第四章、含人GM-CSF的双特异性抗独特型抗体融合蛋白疫苗免疫应答及免疫保护机制研究
　　 目的：构建并表达含人GM-CSF的双特异性抗独特型抗体疫苗GM-CSF-G22-I50，观察人GM-CSF和G22-I50的协同抗肿瘤作用，并对其机制作探讨。
　　 方法：常规分离人PBMC并抽提其RNA，PCR扩增GM-CSF基因，分别插入空载体pET25b(+)和已构建的重组质粒pET25b-G22-150的上游多克隆位点，构建重组质粒pET25b-GM-CSF，pET25b-GM-CSF-G22-I50，以酶切和测序法进行鉴定。通过诱导表达、纯化、复性等一系列过程获得有活性的GM-CSF、GM-CSF-G22-I50蛋白，并用Western blot、ELISA方法来验证蛋白的活性。将不同的蛋白疫苗GM-CSF、G22-I50、GM-CSF-G22-I50分别于背部皮下接种Balb/c小鼠，PBS免疫作为阴性对照，分别通过间接ELISA、竞争抑制ELISA法，淋巴细胞增殖实验、细胞毒性实验检测免疫小鼠的体液免疫和细胞免疫反应情况，并通过双抗夹心ELISA法检测免疫小鼠的细胞因子分泌情况。以腹腔注射PBMC法重建SCID小鼠的免疫系统，分别将上述几种抗独特型抗体疫苗免疫hu-PBL-SCID小鼠，并接种鼻咽癌细胞HNE2，定期检测肿瘤体积、记录肿瘤形成的潜伏期，生存时间；以RT-PCR法检测了肿瘤组织中转录因子T-bet、GATA-3、RORγt、Foxp3的表达情况，并检测了肿瘤组织中ITAC及脾细胞中CXCR3的表达，以双抗夹心ELISA法检测了小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17和TGF-γ的水平，以评价各疫苗的抗肿瘤效应。
　　 结果：成功的构建了原核表达载体pET25b-GM-CSF，pET25b-GM-CSF-G22-I50，并获得了有活性的GM-CSF、GM-CSF-G22-I50蛋白。将各种蛋白疫苗免疫Balb/c小鼠后，通过间接ELISA、竞争抑制ELISA法检测发现GM-CSF-G22-I50蛋白免疫组小鼠体内能够产生较强的Ab3抗体，且该抗体可以与Ab1(FC2 mAb)竞争结合HNE2细胞相关抗原；淋巴细胞增殖实验显示，各组免疫小鼠的脾脏淋巴细胞在体外经1μg/mL蛋白刺激后，淋巴细胞增殖能力最强，且以GM-CSF-G22-I50蛋白免疫组为著，分泌的细胞因子主要以Th1型细胞因子为主；细胞毒性实验结果发现，与G22-I50、GM-CSF、PBS组相比，GM-CSF-G22-I50组小鼠脾淋巴细胞对HNE2细胞的特异性杀伤作用明显增强。利用hu-PBL-SCID小鼠模型，观察各疫苗的抗肿瘤免疫保护作用，结果发现，与G22-I50、GM-CSF、PBS组相比，GM-CSF-G22-I50蛋白免疫组小鼠的肿瘤形成潜伏期明显延长，肿瘤体积减小，生存时间延长；RT-PCR法检测发现，GM-CSF-G22-I50组小鼠肿瘤组织周围T-bet、GATA-3、RoRγt、ITAC及脾细胞CXCR3的表达明显增加，且脾细胞培养上清中分泌的细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17明显增多，而IL-10、TGF-β明显减少。
　　 结论：含人GM-CSF的双特异性抗独特型抗体融合蛋白疫苗能够显著增强体液免疫、细胞免疫反应能力，从而发挥其抗肿瘤免疫保护作用，这可能与肿瘤周围浸润的正向调节T细胞增多，抑制性T细胞减少有着密切的关系。