维生素D类似物EB1089对前列腺癌DU145细胞的作用研究

摘要

研究背景：
　　 前列腺癌在美国是男性最常见恶性肿瘤之一，肿瘤死亡率位居第二。近年来，我国前列腺癌的检出率已呈明显上升趋势。目前，晚期雄激素非依赖型前列腺癌(AIPC)的治疗仍是一个难题，尚无理想的治疗方法。因此，研究和探索新的治疗策略，具有十分重要的临床意义。
　　 研究表明，Hedgehog(Hh)信号通路的激活与前列腺癌密切相关。人前列腺癌组织表达Hh配体及其下游靶基因Gli。Hh信号通路抑制剂cyclopamine(环杷明)能抑制前列腺癌肿瘤细胞增殖、改变其侵袭能力、抑制移植肿瘤的生长并引起消退。但cyclopamine因含量少，合成困难，副作用大，限制了其临床应用。最近研究发现维生素D也是一种Hh信号通路抑制剂，以很高的亲和力结合Smo，抑制Gli活性，且作用强于cyclopamine。
　　 前列腺癌的多药耐药(MDR)是导致其化疗失败的主要原因，肿瘤细胞MDR的发生与细胞膜上过量表达的ABC转运蛋白有关，包括P-型糖蛋白(PGP)、多药耐药蛋白(MRP)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)等，它们可以将化疗药物泵出细胞外从而导致肿瘤细胞产生耐药性。研究表明，Hh通路抑制剂是一种有效的ABC转运蛋白抑制剂，特别是对PGP、BCRP具有很强的抑制作用。
　　 然而，维生素D可引起高血钙的副作用影响了其在抗肿瘤领域的临床应用。EB1089是一种维生素D类似物，具有更强的调节肿瘤细胞生长、分化的作用，而对血钙的影响较小。本研究旨在探讨EB1089是否作为一种Hh通路抑制剂，通过Hh信号通路途径抑制雄激素非依赖型前列腺癌DU145细胞生长，逆转其MDR。
　　 方法与结果：
　　 首先采用MTT法和流式细胞技术检测EB1089对DU145细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响，并与cyclopamine作比较，同时在光镜和电镜下观察细胞形态学和超微结构变化。结果显示，EB1089可以抑制DU145细胞的增殖，差异有统计学意义，呈时间和剂量依赖关系，且抑制作用强于cyclopamine。1、10、50、100nmol/L EB1089作用DU145细胞48h后，G0/G1期细胞逐渐增多，而S期细胞逐渐减少，细胞凋亡率逐步增高。EB1089作用后，镜下可见DU145细胞典型的凋亡形态学改变：细胞体积缩小，细胞核固缩、裂解，核碎片及凋亡小体形成。
　　 其次，分别用1、10、50、100nmol/L浓度的EB1089作用DU145细胞48h后，采用Real time-PCR和Western blot方法分别检测DU145细胞Gli1、cyclinD1、BCL-2、Bax mRNA和蛋白的表达变化。结果显示，EB1089作用48h后，DU145细胞Gli1、cyclinD1、Bcl-2 mRNA和蛋白表达均下降，Bax mRNA和蛋白表达均上调，并呈剂量依赖关系。
　　 最后，MTT法检测EB1089和多西紫杉醇二者合用对DU145细胞增殖的作用，以及EB1089对耐多西紫杉醇DU145细胞(DU145-DR)化学敏感性的影响；并采用Real time-PCR和Western blot方法分别检测EB1089作用后DU145-DR细胞PGP/MDR1、MRP、BCRP mRNA和蛋白的表达变化，结果显示，两药联合对DU145细胞增殖的抑制作用显著高于两药单独作用；DU145-DR细胞经EB1089作用后对多西紫杉醇的敏感性增加，逆转倍数为2.87，相对逆转效率为70.8％；EB1089作用后，DU145-DR细胞PGP/MDR1、BCRP的表达水平显著下调。
　　 结论：
　　 EB1089可以抑制DU145细胞增殖，抑制作用于强于cyclopamine，EB1089可以阻滞DU145细胞于G1期，诱导DU145细胞凋亡，其作用机制可能是作为一种有效的Hh信号通路抑制剂，通过抑制Hh信号通路，下调Gli1，进而调节cyclinD1、Bcl-2和Bax的表达来完成。EB1089可以提高耐多西紫杉醇DU145细胞的化学敏感性，有效逆转其耐药性，其逆转机制可能主要通过下调PGP/MDR1、BCRP的表达来实现，EB1089与多西紫杉醇合用抑制DU145细胞增殖呈协同效应。