II型糖尿病小鼠模型尿液代谢组学的研究

摘要

糖尿病是一种胰岛素缺乏或胰岛素生物功能缺失而引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱等的代谢性疾病,可引起多种严重的并发症。良好的糖尿病动物模型(DM模型)是研究Ⅱ型糖尿病的基础,建立合适的糖尿病动物模型,研究糖尿病及其并发症的发病机制,对于及早发现并预防糖尿病具有非常重要的现实意义。
　　 代谢组学是一门通过组群指标分析,进行高通量检测和数据处理,研究生物体整体或组织细胞系统的动态代谢变化,特别是对内源代谢、遗传变异、环境变化乃至各种物质进入代谢系统的特征和影响的学科。当前代谢组学研究中存在的两个主要问题:一是对代谢产物的定性、定量分析,二是代谢产物复杂数据分析体系中有用信息的挖掘和解释,例如如何将代谢组学的研究结果与病理药理学研究有效相结合。本论文针对这两个问题展开研究,一是利用气相色谱-质谱(GC-MS)联用仪,结合有效的提取和硅烷化技术,建立稳定的尿液代谢物的测定以及定性定量方法;二是结合化学计量学方法中的多元分辨和模式识别方法,分析比较了一组糖尿病动物小鼠模型C57BL/6J小鼠/AMPKα2-KO小鼠/KK-ay小鼠)的尿液代谢图谱,分别建立了不同模型中不同种类的老鼠的三维判别模型,筛选变量寻找生物标记物。本论文的主要内容包括:
　　 一、采用通用的衍生方法,结合GC-MS色谱联用技术,对8例健康小鼠(C57BL/6J)、8例糖尿病小鼠(KK-ay)以及78例由健康C57BL/6J敲除AMPKα2基因所得小鼠(简称AMPKα2-KO小鼠,39例雄性,39例雌性)的尿液进行提取和分析,建立尿液的代谢图谱。借助于直观推导式演进特征投影法(HELP)和选择性离子分析法(SIA)对重叠色谱峰进行分辨和解析,对其中78种内源性物质进行质谱定性。通过对定性定量结果的比较,寻找三类不同种类小鼠代谢产物之间的差异。
　　 二、采用单变量 t-检验的方法,分析了C57BL/6J小鼠和AMPKα2-KO小鼠的尿液代谢差异,采用PCA对这两类小鼠进行聚类,结果显示两类小鼠具有明显的差别;
　　 三、结合化学计量学模式识别的方法,初步建立AMPKα2-KO小鼠不同性别之间的偏最小二乘-线性判别模型(PLS-LDA);运用一种新的变量筛选方法——子窗口随机化分析法(SPA)对变量进行筛选,结合偏最小二乘-线性判别分析法(PLS-LDA)对AMPKα2-KO小鼠性比之间的差异进行判别分析,建立新的判别模型,所得新的SPA-PLS-LDA模型与原始模型相比,识别和预测的能力均有了很大的提高。
　　 四、运用了一种对多类数据进行变量筛选的方法——MCTree分析法,分析了AMPKα2-KO小鼠与周龄相关的规律性变化,筛选出了在这个周期性变化过程中,尿液中含量水平有明显变化的8种代谢物,同时还初步地解释了这些生物标记物的的生物学意义,为Ⅱ型糖尿病的发病机理研究具有一定的指导意义。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 代谢组学概述

1.2 代谢组学简介

1.2.1 代谢组学的发展

1.2.2 代谢组学的应用领域

1.2.3 代谢组学的研究方法及分析流程

1.2.4 代谢组学研究的技术平台

1.3 Ⅱ型糖尿病

1.3.1 糖尿病简介

1.3.2 糖尿病的分类及发病原因

1.3.3 Ⅱ型糖尿病的特点

1.4 化学计量学方法在代谢组学中的应用

1.5 本文的研究内容

第二章 Ⅱ型糖尿病小鼠模型尿液小分子代谢物的衍生及提取

2.1 引言

2.2 试验动物

2.3 模型动物的饲养条件及样本采集

2.4 试剂与仪器

2.4.1 主要试剂配制

2.4.2 主要试剂

2.4.3 主要仪器

2.5 实验部分

2.5.1 小鼠尿液内源性物质的衍生及提取

2.5.2 GC/MS分析

2.5.3 代谢物的定性定量分析

2.6 结果与讨论

2.6.1 尿样的采集和保存条件

2.6.2 尿样的提取、衍生条件的优化

2.6.3 GC/MS条件的优化及确定

2.6.4 小鼠尿液代谢图谱的建立

2.7 本章小结

第三章 三种不同小鼠尿液代谢谱的分析

3.1 引言

3.2 尿样中代谢物质的定性分析

3.2.1 纯物质对照定性法对几种糖进行定性

3.2.2 直观推导式演进特征投影法(HELP)解析重叠峰

3.2.3 选择性离子分析法(Selective Ion Analysis,SIA)

3.3 结果与讨论

3.3.1 C57BL/6J健康大鼠、AMPKα2-KO小鼠和KK-ay糖尿病小鼠尿液样本中代谢谱的定性结果

3.3.2 实验结果分析

3.4 本章小结

第四章 化学计量学方法用于C57BL/6J小鼠和AMPKα2-KO小鼠的判别分析及生物标记物的寻找

4.1 引言

4.2 理论部分

4.2.1 自标度化(autoscaling)

4.2.2 主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)

4.2.3 偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)

4.2.4 线性判别分析(Linear Discriminant Analysis,LDA)

4.2.5 子窗口随机化分析法(Subwindow Permutation Analysis)

4.2.6 Monte Carlo Tree分析法

4.2.7 交互检验法(Cross Validation,CV)

4.2 实验部分

4.3.1 实验数据

4.3.2 数据分析

4.3 结果与讨论

4.4.1 雄性C57BL/6J小鼠(健康)与AMPKα2-KO小鼠尿液代谢图谱的分析

4.4.2 雄性C57BL/6J小鼠(健康)与AMPKα2-KO小鼠尿液代谢图谱的主成分分析

4.4.3 AMPKα2-KO小鼠性别之间差别的尿液代谢图谱的分析

4.4.4 雄性AMPKα2-KO小鼠不同周期形成的尿液“代谢轨迹”代谢图谱的分析

4.4 本章小结

结论与展望

参考文献

致谢

攻读学位期间主要研究成果