甲醛诱导雌性大鼠卵巢及子宫毒性研究

摘要

甲醛(formaldehyde，FA)，又名蚁醛，分子式为CH3CHO，含有一不饱和羰基，具有强氧化性，化学性质非常活泼。甲醛广泛地存在人们的衣食住行中，如室内装修材料、印刷油墨、纺织纤维、化妆品、杀虫剂、清洁剂、消毒剂、防腐剂及各种燃料的燃烧中均不同程度地含有甲醛。特别是近20多年来，随着我国大规模开发建筑装饰、房屋市场，使得人们接触甲醛的机会比以往大大增加。据报道，在室内装修材料内含有的脲醛树脂可缓慢释放低浓度甲醛几年甚至几十年，可对人体的健康造成潜在的远期危害。
　　 体外实验表明，甲醛是一种遗传毒性致癌物，可诱导外周血淋巴细胞、人白血病细胞(HL-60)、肺巨噬细胞、睾丸细胞等细胞发生DNA双链断裂损伤(DSB)，而且随着甲醛浓度的增加，细胞主要呈现出DNA-DNA、DNA-蛋白质(DPC)的交联效应。流行病学研究亦证实，长期低浓度甲醛接触可导致眼和呼吸道炎症、支气管哮喘、神经行为异常及鼻咽癌、肺癌等疾病发生风险增加。对雌性个体，甲醛还可致不孕(Infertility)、死胎(Stillbirth)及胎儿畸形(Fetal malformation)等生殖毒性。但目前，甲醛诱导雌性动物生殖毒性的生物学机制仍未完全清楚，特别是在低剂量接触条件下，从细胞分子水平上阐明甲醛的毒性机制显得尤为必要。卵巢与子宫是雌性动物发挥生殖功能的重要器官，通过卵巢组织中卵原细胞的有丝分裂及减数分裂，从而形成成熟的卵母细胞(卵子)，并经输卵管进入子宫等待受精，如果雌性个体在性成熟期受到甲醛的毒性作用，那么卵母细胞的发育、成熟及受精均会受到影响，有可能会出现流产(abortion)、死胎等难以预测的严重后果。
　　 因此，我们以雌性SD大鼠为实验对象，分别进行低、中、高不同浓度甲醛染毒处理，收集大鼠的血清、卵巢及子宫组织，分别从卵巢储备功能、卵巢组织细胞形态学、组织中细胞凋亡相关基因mRNA及蛋白质表达等方面阐述了甲醛对雌性大鼠卵巢及子宫产生损伤的细胞及分子毒理学特征，为甲醛雌性生殖毒性机制的阐明提供参考依据。
　　 第一部分、甲醛对雌性大鼠卵巢功能及组织结构的毒性研究
　　 (一)甲醛对雌性SD大鼠卵巢储备功能的影响
　　 目的：探讨甲醛对雌性SD大鼠卵巢储备功能的毒性作用。
　　 方法：将40只SD雌性大鼠随机分为正常对照组和3个不同浓度(0.2、2.0、20.0 mg/kg)的甲醛染毒组。腹腔注射甲醛染毒，每天1次，连续染毒14天，14天后采用股动脉放血法处死受试动物，并收集血清，用化学发光法测定血清雌二醇(E2)浓度；用酶联免疫方法测定抑制素B(inhibin B)浓度；用放射免疫方法测定卵泡刺激素(FSH)和黄体生成激素(LH)的浓度。同时解剖摘取卵巢称重，计算脏器系数。
　　 结果：甲醛染毒组与对照组比较，各染毒剂量组大鼠血清E2、Inhibin B水平明显降低(P<0.05)，FSH水平显著升高(P<0.05)；高、中剂量组大鼠血清LH水平均有所升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。各染毒剂量组卵巢脏器系数显著降低(P<0.05)。
　　 结论：甲醛对SD雌性大鼠卵巢储备功能有一定损害作用。
　　 (二)甲醛对雌性SD大鼠卵巢组织和细胞显微及超微结构的影响
　　 目的：研究甲醛对雌性大鼠卵巢组织结构、卵母细胞及颗粒细胞的显微及超微结构的影响。
　　 方法：将40只SD雌性大鼠随机分为正常对照组和3个不同浓度甲醛染毒组，腹腔注射甲醛，剂量分别为20.0、2.0和0.2 mg/kg，每天1次，连续14天，14天后处死所有大鼠取卵巢组织，应用HE染色光镜观察雌性大鼠卵巢组织病理形态变化，应用电镜技术观察雌性大鼠卵母细胞及颗粒细胞超微结构的变化，应用原位末端转移酶标记法(TUNEL)检测卵母细胞及颗粒细胞凋亡的情况。
　　 结果：甲醛可引起雌性大鼠卵巢组织发生病理学改变，如卵巢皮质轻度萎缩、结构紊乱，间质小血管扩张充血及纤维组织增生等病理改变，其病理变化程度与甲醛呈剂量依赖性；电镜检查发现甲醛可破坏卵母细胞、颗粒细胞超微结构，出现细胞核模糊、不规则，粗面内质网及线粒体数量明显减少，线粒体肿胀及嵴模糊，以及核膜皱缩、染色质边集、核仁变小或消失等细胞早期凋亡特征。其细胞超微结构变化的程度与甲醛亦呈剂量依赖性；TUNEL染色观察发现甲醛染毒组大鼠卵母细胞和颗粒细胞的凋亡率均高于对照组，且中、高剂量组和对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。
　　 结论：甲醛对雌性大鼠的卵巢组织结构、卵母细胞及颗粒细胞的超微结构造成不良影响，促使卵母细胞及颗粒细胞呈凋亡发展趋势。
　　 第二部分、甲醛诱导雌性大鼠卵巢组织Fas凋亡途径基因及蛋白表达变化
　　 目的：观察甲醛对雌性大鼠卵巢组织Fas，半胱氨酸蛋白酶caspase-8和caspase-3表达的影响，探讨甲醛对雌性大鼠卵巢毒性的分子机制。
　　 方法：将40只雌性SD大鼠随机分为正常对照组和3个不同浓度甲醛处理组，腹腔注射甲醛，剂量分别为20.0、2.0和0.2 mg/kg，每天1次，连续14天后处死所有大鼠后取卵巢组织，用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Fas和半胱氨酸蛋白酶(caspase-8)mRNA表达，免疫印迹法(Western-Blot)检测Fas蛋白表达，分光光度法(UV-visible spectrophotometry)检测caspase-8和caspase-3的活性。
　　 结果：甲醛染毒组卵巢组织Fas与caspase-8 mRNA表达以及caspase-8和caspase-3活性明显高于对照组，且随剂量的增加而增加(P<0.05)。
　　 结论：Fas基因表达与caspase活性增强可能是甲醛诱导雌性动物卵巢毒性的重要机制。
　　 第三部分、甲醛对雌性SD大鼠卵巢及子宫组织线粒体依赖性细胞凋亡相关基因表达的干扰效应
　　 目的：观察甲醛对雌性大鼠卵巢及子宫组织线粒体依赖性细胞凋亡途径相关基因VDAC1、ANT1、hOGG1 mRNA表达水平的影响。
　　 方法：将20只雌性SD大鼠随机分为正常对照组和3个不同浓度甲醛处理组，腹腔注射甲醛，剂量分别为40.0、4.0和0.4 mg/kg，每天1次，连续5天后处死所有大鼠，取卵巢组织及子宫组织，应用逆转录荧光定量PCR法(RT-qPCR)检测了电压依赖性阴离子通道(VDAC1)、腺苷酸转运蛋白(ANT1)、8-羟基鸟嘌呤糖苷酶(hOGG1)基因的mRNA表达水平变化。
　　 结果：甲醛染毒处理后，在卵巢和子宫组织，VDAC1、ANT1基因mRNA表达水平明显增加，其中子宫组织相比而言增加较为明显，在低、中、高剂量组织均明显增加(P<0.05)。而对于hOGG1而言，卵巢和子宫组织表达相类似，在低剂量甲醛组，hOGG1 mRNA表达变化不明显，在中、高剂量甲醛处理组，hOGG1 mRNA表达明显降低(P<0.05)。
　　 结论：甲醛可诱导雌性大鼠卵巢及子宫组织VDAC1、ANT1mRNA表达水平异常增加以及氧化损伤修复基因hOGG1 mRNA表达明显降低，可能与线粒体损伤诱发的细胞凋亡程序激活有关。
　　 综上三个部分所述，在不同剂量甲醛染毒条件下，甲醛可诱导雌性大鼠卵巢储备功能产生损害，主要表现为血清雌二醇(E2)、抑制素B(inhibin B)浓度明显降低，而卵泡刺激素(FSH)水平明显升高。同时甲醛可对大鼠卵巢组织、卵母细胞及颗粒细胞产生病理性损害，引起卵巢皮质萎缩、结构紊乱，纤维组织增生等病理改变以及卵母细胞、颗粒细胞的超微结构呈现细胞核膜皱缩、线粒体肿胀、核仁变小或消失等早期细胞凋亡特征。在分子水平上我们亦发现甲醛可诱导大鼠卵巢或子宫组织Fas凋亡途径及线粒体依赖性细胞凋亡途径相关基因Fas、caspase-8、caspase-3、VDAC1、ANT1及hOGG1的表达水平出现异常，可能与进一步Fas或线粒体依赖性细胞凋亡程序的激活，细胞凋亡发生有关。