肾癌中EZH2表达的临床意义及靶向EZH2的siRNA对肾癌ACHN细胞影响的实验研究

摘要

研究背景:肾癌又称肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是临床最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一，占到了所有成人恶性肿瘤的2-3％。在西方国家其发病率较高，在欧洲每年一般较上一年有2％的增幅，这与一些能够发现无症状RCC的先进检查技术的应用及人们对RCC认识的加深有着一定的关系。尽管在一些北欧国家如瑞典和丹麦，RCC发病率维持稳定甚至有小幅的下降，但是在其他的欧洲国家，其发病率仍呈现增长趋势。在我国泌尿外科恶性肿瘤发病率中，RCC仅次于膀胱癌，占第二位。60到70岁之间是RCC的发病高发年龄段，其男女患者性别比为3∶2。其发病原因与吸烟，高血压、高血脂都有一定程度的关系。因为肾在体内位置比较隐蔽，加之临床症状多变，RCC难以早期发现，约有半数的肾癌是偶然发现的。典型的肾癌三联征（腰痛、肉眼血尿及腰腹部包块）仅见于约6-10％的RCC患者。RCC确诊时约35％的患者已有淋巴转移，而一旦出现转移，即使行肾癌根治术，患者生存期也极少超过5年，RCC患者若出现肝肺骨等远处脏器转移则预后更差。RCC对放、化疗均不敏感，因此RCC的常规辅助治疗不包括放、化疗等治疗。新的治疗手段如基因靶向治疗等虽有望成为治愈RCC的有效治疗方法之一，但是目前最突出的问题是缺乏理想而可靠的治疗标靶。因此寻找调控RCC基因治疗的分子标靶，明确其在RCC发生发展过程中的机制，已逐渐成为目前研究工作的重点和热点。
　　 EZH2(enhancer ofzeste homolog2)基因与果蝇zeste基因增强子(E(z))是同源基因，是聚硫蛋白复合物基因家族(polycomb group，PcG)中的一员，是一种进化上高度保守的基因。PcG家族和与其有着拮抗作用的Trithorax group(TrxG)基因家族都是在进化过程中保守的染色质修饰基因，他们共同调控同源异形基因(homeotic gene)的沉默和活化，其中同源异形基因的激活由TrxG蛋白决定，而PcG蛋白则维持基因的失活状态。1996年，EZH2基因最早由Chen等人研究Down氏综合症致病基因位点的毗邻基因时发现。有研究表明EZH2可抑制正常细胞中的抑癌基因的表达，从而促进细胞的异常增殖，并且能够刺激肿瘤细胞的转移与扩散。近年来越来越多的研究证实人EZH2蛋白和DNA甲基转移酶功能有相关性，通过后者参与了DNA甲基化;还有部分学者认为由于EZH2可抑制抑癌基因的表达，因此其可导致肿瘤细胞中基因表达的异常。由此可推断EZH2可能成为一种新的肿瘤标志物。
　　 RNA干扰(RNAi)最先由Fire等在1998年提出，具有特异性强、作用效率高、干扰作用可扩散及操作简单等优点，对目的基因有着很强的抑制作用。转录后抑制是RNAi的主要机制，其作用过程可基本上分为启动阶段和效应阶段，所使用的转染表达载体包括质粒、病毒和人造载体等。基因外显子序列是RNAi的作用靶点位，尤其是保守序列其干扰效果最好;而其对基因的启动子、内含子和终止子等序列无干扰作用。通过RNAi对肾癌细胞EZH2基因的沉默，我们希望能够找到以下问题的答案:EZH2基因在RCC发生发展中的作用如何？其与细胞周期调节和信号转导之间的关系如何？其机制可能是什么？关于这系列问题目前尚无系统研究与相应报告。
　　 基于此目的和背景，本研究拟进行:
　　 1.EZH2在人RCC组织及RCC细胞系ACHN中的表达及意义;
　　 2.靶向EZH2的siRNA真核干预载体的构建;
　　 3.在RCC细胞株ACHN利用siRNA敲减EZH2，了解其对RCC细胞增殖、凋亡及侵袭力的影响;
　　 4.探讨干扰EZH2对肾癌ACHN细胞相关细胞信号通路表达的影响。
　　 第一部分EZH2在人肾癌组织及细胞系中表达水平的研究
　　 目的:1.研究EZH2在RCC组织和“正常”肾脏组织中的表达情况及意义;2.研究EZH2基因mRNA及EZH2蛋白在人肾癌细胞株ACHN及成人正常肾近曲小管上皮细胞株HK-2中的表达情况，作为后续实验基础。
　　 方法:1.应用S-P免疫组织化学技术检测66例RCC及8例对照标本为肾脏外伤后切除的肾脏（病理证实为正常肾脏组织）组织中的EZH2表达，并结合标本来源患者的临床和病理资料进行分析;2.采用逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcription-Ploymerase chainreaction，RT-PCR)检测人肾癌细胞株ACHN及人正常肾近曲小管上皮细胞株HK-2中EZH2基因mRNA含量，免疫印记Western Blot分别检测细胞株ACHN和HK-2中的EZH2蛋白含量。
　　 结果:1.66例RCC组织中EZH2蛋白的表达情况:阳性48例，阴性18例，阳性率为72.7％;8例“正常”肾脏组织中EZH2蛋白的表达情况:阳性1例，阴性7例，阳性率为12.5％，两者比较RCC中EZH2蛋白阳性率明显高于“正常”肾脏组织，P=0.002。2.EZH2在RCC组织中的表达与肿瘤的临床Robson分期、肿瘤直径大小、淋巴结转移与否、肾癌的病理类型相关(P＜0.05);而与患者年龄、性别、病理Fuhrman分级无相关性(P＞0.05)。3.RT-PCR检测EZH2条带显影定位于193bp处，内参GAPDH条带显影定位于450bp处。根据所测得IOD比值计算(IODEZH2/IODGAPDH)，ACHN细胞株EZH2基因mRNA含量（0.648±0.003）明显高于HK-2细胞株（0.333±0.025），表达差异具有显著性(P＜0.01)。4.Western blot检测EZH2条带显影定位于80KD处，内参GAPDH条带显影定位于37KD处。根据所测得IOD比值计算(IODEZH2/IODGAPDH)，ACHN细胞株EZH2蛋白表达（0.290±0.009）明显高于HK-2细胞株（0.136±0.012），表达差异具有显著性(P＜0.01)。
　　 结论:1.EZH2在RCC组织中明显高表达，并且与肿瘤的临床分期相关，提示其与RCC的发生、发展密切相关，对于人RCC的早期诊断及预后判断可能有重要的意义;2.人肾癌细胞株ACHN中EZH2基因mRNA含量和EZH2蛋白含量明显高于成人正常肾近曲小管上皮细胞系HK-2，ACHN细胞株可以作为后续实验的研究对象。
　　 第二部分靶向EZH2的siRNA有效序列的确定和干预载体的构建
　　 目的:构建针对目的基因EZH2的siRNA干预载体，并证实该载体转染人肾癌ACHN细胞后是否对EZH2基因表达有抑制作用。
　　 方法:根据已有文献报道选择EZH2基因cDNA序列的461-481碱基为标靶序列，设计目的shRNA所对应的DNA模板链，退火处理后克隆到含U6启动子的空质粒载体pGPU6/GFP/Neo，并构建重组质粒:pGPU6/GFP/Neo-EZH2 shRNA，经酶切测序证实后，脂质体介导将pGPU6/GFP/Neo-EZH2 shRNA转染人肾癌ACHN细胞株。再以Western Blot方法检测EZH2蛋白表达是否下降以证实该载体的作用。
　　 结果:将靶向EZH2基因RNAi的shRNA模板顺利插入空质粒载体，抽提并纯化正确重组质粒，根据所设立的三个平行组:A组为空白组（ACHN细胞未转染质粒组）、B组为阴性对照组（ACHN细胞转染pGPU6/GFP/Neo空质粒组）和C组为干扰组(ACHN细胞转染pGPU6/GFP/Neo-EZH2 siRNA组)。以Western blot法检测转染后三组ACHN细胞EZH2蛋白表达，根据所测得IOD比值计算(IODEZH2/IODGAPDH)，C组ACHN细胞EZH2蛋白表达明显低于A、B两组ACHN细胞(P＜0.01)，A、B两组ACHN细胞EZH2蛋白表达无明显差异(P＞0.05)。
　　 结论:1.成功构建了pGPU6/GFP/Neo-EZH2 shRNA稳定表达质粒;2.成功构建了EZH2 siRNA稳定表达的细胞;3.EZH2 siRNA显著下调了人肾癌细胞株ACHN细胞EZH2蛋白的表达。
　　 第三部分干扰EZH2基因对人肾癌细胞株ACHN增殖、凋亡及侵袭能力的影响
　　 目的:使用特异性的EZH2-shRNA干扰序列转染人肾癌细胞株ACHN，诱导EZH2基因沉默，观察其对ACHN细胞增殖活性、凋亡及侵袭能力的影响。
　　 方法:使用第二部分中构建的干预载体在最佳转染条件下，用质粒载体法转染ACHN细胞株，根据所设立的三个平行组:A组为空白组（ACHN细胞未转染质粒组）、B组为阴性对照组（ACHN细胞转染pGPU6/GFP/Neo空质粒组）和C组为干扰组（ACHN细胞转染pGPU6/GFP/Neo-EZH2 siRNA组），应用MTT法、流式细胞术（Annexin V/PI双染法）及Transwell细胞侵袭实验分别检测三组中ACHN细胞株的细胞增殖、凋亡及侵袭能力。
　　 结果:1.流式细胞仪检测三组ACHN细胞凋亡指数AI值，根据所测得AI值(％)计算，C组ACHN细胞凋亡指数高于A、B两组ACHN细胞凋亡指数，有统计学意义(P＜0.05);而A、B两组ACHN细胞凋亡指数比较无统计学差异(P＞0.05)。2.分别于转染24h、48h、72h及96h后，MTT比色法检测三组ACHN细胞的细胞增殖情况，除24h点外(P＞0.05)，其余时间点（48h、72h及96h）MTT检测C组ACHN细胞570nm波长处OD值明显低于A、B两组ACHN细胞(P＜0.01)，且有统计学意义。3.Transwell实验检测三组ACHN细胞的侵袭能力，根据所测得下室中细胞数计算，C组ACHN细胞进入下室内的细胞数量明显少于A、B两组ACHN细胞，且有统计学意义(P＜0.01);而A、B两组ACHN细胞进入下室内的细胞数量比较无统计学意义(P＞0.05)。
　　 结论:1.EZH2 siRNA能够明显促进ACHN细胞的凋亡;2.EZH2siRNA能够明显抑制ACHN细胞的增殖，并且这种抑制作用存在时间效应关系;3.EZH2 siRNA能够明显抑制ACHN细胞的侵袭能力。
　　 第四部分EZH2-siRNA抑制人肾癌细胞株ACHN的分子生物学机制及与WNT/β-catenin信号通路系统关系的实验研究
　　 目的:探讨EZH2-siRNA抑制人肾癌细胞株ACHN的分子生物学机制及与WNT/β-catenin信号通路系统的关系。
　　 方法:同第三部分设立A组:空白组（未转染组）、B组:对照组（阴性对照载体组）和C组:RNA干扰组（干扰载体组）三组。应用RT-PCR检测三组ACHN细胞WNT3α、β-catenin、GSK-3βmRNA的变化，Western Blot检测三组ACHN细胞WNT3α、β-catenin、GSK-3β蛋白的表达。
　　 结果:1.PCR检测WNT3α条带显影定位于243bp处，β-catenin条带显影定位于194bp处，GSK-3β条带显影定位于153bp处，内参GAPDH条带显影定位于450bp处。根据所测得WNT3α、β-catenin及GSK-3β的IOD值分别与各自同时进行电泳的内参GAPDH的IOD值计算IOD比值(IODWNT3α/IODGAPDH、IODβ-catenin/IODGAPDH、IODGSK-3β/IODGAPDH)，C组ACHN细胞GSK-3β基因mRNA含量明显高于A、B两组ACHN细胞，表达差异具有显著性(P＜0.01，P＜0.05);而WNT3α、β-catenin基因mRNA在C组ACHN细胞中的含量明显低于A组ACHN细胞(P＜0.01，P＜0.01)和B组ACHN细胞(P＜0.01，P＜0.05)，表达差异具有显著性。A、B两组ACHN细胞WNT3α、β-catenin及GSK-3β三种基因mRNA含量差异无统计学差异(P＞0.05)。2.Western blot检测WNT3α条带显影定位于43KD处，WNT3α条带显影定位于92KD处，WNT3α条带显影定位于47KD处，内参GAPDH条带显影定位于37KD处。根据所测得WNT3α、β-catenin及GSK-3β的IOD值分别与所测内参GAPDH的IOD值计算IOD比值(IODWNT3α/IODGAPDH、 IODβ-catenin/IODGAPDH、IODGSK-3β/IODGAPDH),C组ACHN细胞GSK-3β蛋白表达明显高于A、B两组ACHN细胞，表达差异具有显著性(P＜0.01);而WNT3α、β-catenin蛋白在C组ACHN细胞中的表达明显低于A、B两组ACHN细胞，表达差异具有显著性(P＜0.01)。
　　 结论:1，EZH2 siRNA能够明显抑制肾癌ACHN细胞中WNT3α、β-catenin基因mRNA及蛋白的表达;2.EZH2 siRNA能够明显促进肾癌ACHN细胞中GSK-3β基因mRNA及蛋白的表达;3.EZH2 siRNA可通过WNT/β-catenin信号转导通路抑制RCC的发生、发展。

目录

声明

摘要

英文缩略词注释说明

前言

第一部分 EZH2在人肾癌组织及细胞系中表达水平的研究

1 引言

2 EZH2在人肾癌组织中的表达及意义

2．1 材料和方法

2．2 结果

3 EZH2在人肾癌细胞系ACHN中表达水平的研究

3．1 材料和方法

3．2 结果

4 讨论

5 结论

第二部分 靶向EZH2的siRNA有效序列的确定和干预载体的构建

1 引言

2 材料和方法

2．1 材料及主要试剂

2．2 实验方法及步骤

3 结果

4 讨论

5 结论

第三部分 干扰EZH2基因对人肾癌细胞株ACHN增殖、凋亡及侵袭能力的影响

1 引言

2 材料和方法

2．1 材料及主要试剂

2．2 实验方法及步骤

3 结果

3．1 流式细胞仪(Annexin V／PI双染法)检测三组ACHN细胞凋亡结果

3．2 MTT比色法检测三组ACHN细胞的增殖情况

3．3 Transwell实验检测三组ACHN细胞的侵袭能力结果

4 讨论

5 结论

第四部分 EZH2-siRNA抑制人肾癌细胞株ACHN的分子生物学机制及与WNT／β-catenin信号通路系统关系的实验研究

1 引言

2 材料和方法

2．1 材料及主要试剂

2．2 实验方法及步骤

3 结果

3．1 A、B、C三组ACHN细胞WNT3α、β-catenin及GSK-3β基因mRNA水平的检测结果

3．2 A、B、C三组ACHN细胞WNT3α、β-catenin及GSK-3β蛋白表达水平的检测结果

4 讨论

5 结论

参考文献

综述

致谢

攻读博士期间主要的研究成果